末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ

DNAヌクレオチ ジルエキソトランスフェラーゼ （ DNTT ）またはターミナルトランスフェラーゼとしても知られるターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ （ TdT ）は、未熟、プレB、プレTリンパ系細胞、および急性リンパ芽球性白血病/リンパ腫細胞で発現する特殊なDNAポリメラーゼです。 TdTは、抗体遺伝子組換え中にTCRおよびBCR遺伝子のV、D、およびJエクソンにNヌクレオチドを追加し、接合部多様性の現象を可能にします。ヒトでは、ターミナルトランスフェラーゼはDNTT遺伝子によってコードされています。 DNAポリメラーゼ酵素のXファミリーのメンバーとして、それはポリメラーゼλおよびポリメラーゼμとともに機能します。どちらもポリメラーゼXファミリーに属します。 TdTによって導入された多様性は、脊椎動物の免疫系の進化に重要な役割を果たしており、病原体と戦うために細胞に装備されている抗原受容体の多様性を大幅に高めています。 TdTノックアウトマウスを使用した研究では、通常のシステムまたは野生型のシステムと比較して、T細胞受容体（TCR）の多様性が大幅に減少（10倍）していることがわかりました。生物が備えているTCRの多様性が大きいほど、感染に対する抵抗力が大きくなります。

TdTは胎児肝臓HSCには存在せず、胎児期のB細胞の接合部の多様性を著しく損ないます。

機能と規制

TdTは、DNA分子の3 '末端へのヌクレオチドの付加を触媒します。ほとんどのDNAポリメラーゼとは異なり、テンプレートは必要ありません。この酵素の好ましい基質は3'-オーバーハングですが、ヌクレオチドを平滑または凹型3 '末端に追加することもできます。コバルトは必要な補因子であるが、酵素はin vitroで MgおよびMnを投与すると反応を触媒する。

TdTは、胸腺や骨髄などの主なリンパ器官で主に発現します。その発現の調節は、複数の経路を介して起こります。これらには、TdIF1とのようなタンパク質間相互作用が含まれます。 TdIF1は、TdTと相互作用してTdTポリメラーゼのDNA結合領域をマスクすることによりその機能を阻害する別のタンパク質です。 TdT発現の調節も転写レベルで存在し、調節は病期特異的因子の影響を受け、発達的に制限された方法で起こります。発現は通常、一次リンパ器官で見られますが、最近の研究では、抗原を介した刺激により、T細胞の胸腺外での遺伝子再配列に必要な他の酵素とともに二次TdT発現が生じることが示唆されています。

機構

この画像は、抗体遺伝子の再配列の過程でTdTがどのように機能するかを視覚的に表しています。画像はDセグメントとJセグメントを使用していますが、他のセグメントペアでも同じタイプの再配置が発生することを知ってください。

RAG 1/2酵素の作用により、切断された二本鎖DNAには、切断イベントによって作成された各DNAセグメントの末端にヘアピン構造が残ります。ヘアピンは両方ともArtemis複合体によって開かれ、リン酸化されるとエンドヌクレアーゼ活性を持ち、TdTが作用する遊離3'OH末端を提供します。 Artemis複合体がその仕事を行い、パリンドロームヌクレオチド（Pヌクレオチド）を新しく開いたDNAヘアピンに追加すると、TdTが仕事をするための段階が設定されます。 TdTは、ポリメラーゼが機能することが知られている5 'から3'の方向に、既存のPヌクレオチドにNヌクレオチドを追加できるようになりました。アルテミス複合体の作用後に生成される各3 '末端には、平均2-5個のランダムな塩基対が追加されます。追加された塩基の数は、2つの新しく合成されたssDNAセグメントが、通常のWatson-Crick塩基ペアリングパターン（AT、CG）に従って非相同末端結合中にミクロ相同性アライメントを受けるのに十分です。そこから不対合ヌクレオチドは、アルテミス複合体のようなエキソヌクレアーゼ（エンドヌクレアーゼ活性に加えてエキソヌクレアーゼ活性を持っています）によって切り取られ、次にテンプレート依存性ポリメラーゼがギャップを埋めることができ、最終的にリガーゼの作用で新しいコーディングジョイントを作成しますセグメントを結合します。 TdTは、4つの塩基対をNヌクレオチドセグメントに追加しても区別しませんが、グアニンとシトシンの塩基対の偏りを示しています。

ポリメラーゼλは、同様のテンプレートに依存しない合成活性を示すこともわかっています。ターミナルトランスフェラーゼとしての活動とともに、テンプレートに依存した方法でも機能することが知られています。 TdTは、ヌクレオチドを追加するためのテンプレート独立経路を介してのみ機能するため、これは興味深いものです。

用途

ターミナルトランスフェラーゼには分子生物学の用途があります。 RACEで使用してヌクレオチドを追加し、その後のPCRでプライマーのテンプレートとして使用できます。また、TUNELアッセイ、例えば、放射性同位体で標識されたヌクレオチドを追加するために使用することができる（T erminalデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼD U TP N ICKのEの目のLの abeling）断片化DNAによって部分的にマークされるアポトーシスのデモンストレーション（、のために）。また、急性リンパ芽球性白血病の診断のための免疫蛍光アッセイで使用されます。

免疫組織化学では、TdTに対する抗体を使用して、抗原を保有する未熟なT細胞およびB細胞と多能性造血幹細胞の存在を示すことができますが、成熟リンパ系細胞は常にTdT陰性です。 TdT陽性細胞は健康なリンパ節と扁桃腺に少数しか見られませんが、急性リンパ芽球性白血病の悪性細胞もTdT陽性であるため、この病気を診断するためのパネルの一部として抗体を使用できます。たとえば、小児の小細胞腫瘍と区別してください。

TdTは、オリゴヌクレオチドのDe Novo合成にも最近適用されており、TdT-dNTPテザーアナログは、一度に1 ntのプライマー伸長が可能です。言い換えれば、酵素TdTは、プライマー配列に一度に1文字を追加することにより、合成DNAを作成する能力を実証しました。