制限ポイント

制限点 （ R ）は、細胞が細胞周期に「拘束」され、その後細胞外増殖刺激剤が不要になる動物細胞周期のG1の点です。

歴史

もともと、ハワード・マーティン・テミンは、ニワトリ細胞がDNAの複製にコミットし、細胞外シグナルに依存しないポイントに達することを示しました。約20年後の1973年、Arthur PardeeはG1に単一の制限ポイントが存在することを実証しました。以前は、G1は単に有糸分裂とS期の間の時間として定義されていました。 G1における細胞の位置の分子的または形態学的な場所マーカーは知られていない。パーディーはダブルブロック法を使用して、細胞をある細胞周期ブロック（重要なアミノ酸の離脱や血清の離脱など）から別の細胞周期ブロックに移動し、S期への進行を防ぐ各ブロックの効率を比較しました。彼は、調べたすべてのケースで両方のブロックがS相の進行をブロックするのに同等に効率的であり、それらがすべて「制限ポイント」またはRポイントと呼ばれるG1の同じポイントで動作する必要があることを示しました。

1985年、ZetterbergとLarssonは、細胞周期のすべての段階で、血清欠乏によりタンパク質合成が阻害されることを発見しました。有糸分裂後の細胞（すなわち、初期G1の細胞）でのみ、血清回収力細胞が静止状態（G0）になりました。実際、Zetterbergは、細胞が制限ポイントからS期に移動するのにかかる時間で、細胞周期の長さの実質的にすべての変動を説明できることを発見しました。

細胞外シグナル

初期の胚発生を除いて、多細胞生物のほとんどの細胞は、増殖が起こらないG0として知られる静止状態にとどまり、通常、細胞は最終分化します。他の特殊な細胞は、成人期に分裂し続けます。これらの細胞群の両方について、細胞周期を終了して静止状態（G0）になるか、G1に再進入するかの決定が下されました。

細胞が細胞周期に入る、または再入するという細胞の決定は、制限点として知られるG1のS期の前に行われ、受信および処理されるプロモーションおよび抑制細胞外シグナルの組み合わせによって決定されます。 Rポイントの前に、細胞はこれらの細胞外刺激物質がG1の最初の3つのサブフェーズ（能力、エントリG1a、進行G1b）を通じて進行を開始することを必要とします。ただし、G1bでRポイントが渡されると、細胞外シグナルは不要になり、細胞はDNA複製の準備に不可逆的に関与します。さらなる進行は、細胞内メカニズムによって規制されています。細胞がR点に到達する前に覚醒剤を除去すると、細胞が静止状態に戻る可能性があります。これらの条件下では、細胞は実際に細胞周期に戻り、制限ポイントを通過してS期に入った後、追加の時間（培養中の回収時間より約8時間長い）が必要になります。

マイトジェンシグナル

成長因子（PDGF、FGF、EGFなど）は、細胞の細胞周期への侵入と制限点への進行を調節します。このスイッチのような「戻りのないポイント」を通過すると、細胞周期の完了はマイトジェンの存在に依存しなくなります。持続性マイトジェンシグナル伝達は、主にG1サイクリン（サイクリンD1-3）の調節と、MAPKおよびPI3K経路の両方を介して並行して媒介される可能性のあるCdk4 / 6とのアセンブリを通じて、細胞周期の進入を促進します。

MAPKシグナリングカスケード

細胞外成長因子の受容体チロシンキナーゼ（RTK）への結合は、立体構造の変化を引き起こし、RTKの細胞質尾部のチロシン残基の二量体化と自己リン酸化を促進します。これらのリン酸化チロシン残基は、SH2ドメイン（Grb2など）を含むタンパク質のドッキングを促進し、その後、他のシグナル伝達タンパク質を原形質膜に補充して、シグナル伝達キナーゼカスケードをトリガーできます。 RTKに関連するGrb2はSosに結合します。Sosは、膜結合型Rasをその活性型（Ras-GDP⟶{\ displaystyle \ longrightarrow} Ras-GTP）に変換するグアニンヌクレオチド交換因子です。活性型RasはMAPキナーゼカスケードを活性化し、Rafに結合して活性化し、MEKをリン酸化および活性化し、ERKをリン酸化および活性化します（MAPKとしても知られています。MAPK/ ERK経路も参照 ）。

その後、アクティブなERKは核に移行し、そこで転写因子血清反応因子（SRF）などの複数の標的を活性化し、転写因子FosおよびMycなどの初期遺伝子の発現をもたらします。 Fos / Jun二量体は転写因子複合体AP-1を含み、主要なG1サイクリン、サイクリンD1を含む遅延応答遺伝子を活性化します。 Mycはまた、サイクリンD2およびCdk4の誘導を含む、さまざまなプロ増殖遺伝子およびプロ増殖遺伝子の発現を調節します。さらに、ERK活性の持続は、CDK2のリン酸化と核局在化にとって重要であると思われ、制限点を介した進行をさらにサポートします。

PI3K経路シグナリング

別のSH2ドメイン含有タンパク質であるp85は、活性化RTKに結合し、PI3K（ホスホイノシチド-3-キナーゼ）を補充し、リン脂質PIP2をPIP3にリン酸化し、Aktの補充をそのPHドメインを介してもたらします。他の成長促進および生存促進機能に加えて、Aktはグリコーゲンシンターゼキナーゼ-3β（GSK3β）を阻害するため、GSK3βを介したリン酸化とそれに続くサイクリンD1の分解が防止されます（ 図を参照 ）。 Aktは、mTORを介したサイクリンD1翻訳の促進、Cdk阻害剤p27kip1のリン酸化（核移行の防止）およびp21Cip1（安定性の低下）、および転写因子FOXO4のリン酸化の不活性化（p27発現を調節）によってG1 / Sコンポーネントをさらに調節します。一緒に、このサイクリンD1の安定化とCdk阻害剤の不安定化は、G1およびG1 / S-Cdk活性を促進します。

抗マイトジェンシグナル伝達

サイトカインTGF-βのような抗マイトジェンは、制限点を通過する進行を阻害し、G1停止を引き起こします。 TGF-βシグナル伝達はSmadを活性化します。SmadはE2F4 / 5と複合してMyc発現を抑制し、Miz1と結合してCdk阻害剤p15INK4bの発現を活性化し、サイクリンD-Cdk複合体の形成と活性をブロックします。 TGF-βで停止した細胞もp21とp27を蓄積します。

機構

概要

上記のように、細胞外成長因子からのシグナルは典型的な方法で伝達されます。成長因子は細胞表面の受容体に結合し、さまざまなリン酸化カスケードがCa2 +の取り込みとタンパク質のリン酸化をもたらします。リンタンパク質レベルは、ホスファターゼによって相殺されます。最終的に、特定の標的遺伝子の転写活性化が起こります。細胞外シグナル伝達を維持する必要があり、また細胞は迅速なタンパク質合成をサポートするために十分な栄養供給にアクセスできる必要があります。サイクリンDの蓄積は不可欠です。

サイクリンD結合cdks 4および6はcdk活性化キナーゼによって活性化され、細胞を制限点に向かって駆動します。ただし、サイクリンDの回転率は高い（t1 / 2 25分）。この急速な回転率のために、細胞は細胞分裂シグナル伝達レベルに非常に敏感であり、サイクリンD産生を刺激するだけでなく、細胞内のサイクリンDの安定化にも役立ちます。このように、サイクリンDは細胞分裂促進シグナルセンサーとして機能します。Ink4タンパク質やp21などのCdk阻害剤（CKI）は、不適切なサイクリン-cdk活性の防止に役立ちます。

活性サイクリンD-cdk複合体は、核内の網膜芽細胞腫タンパク質（pRb）をリン酸化します。非リン酸化Rbは、E2Fを介した転写を妨げることにより、G1の阻害剤として作用します。リン酸化されると、E2FはサイクリンEおよびAの転写を活性化します。図に示すように、活性サイクリンE-cdkは蓄積を開始し、pRbのリン酸化を完了します。

Cdk阻害剤とサイクリンD / Cdk複合体活性の調節

p27およびp21は、G1 / S-およびS-サイクリン-Cdk複合体の化学量論的阻害剤です。細胞周期に入るとp21レベルが上昇しますが、細胞がG1後期に進行するとp27は一般に不活性化されます。高い細胞密度、マイトジェン飢,、およびTGF-βは、p27の蓄積と細胞周期停止をもたらします。同様に、DNA損傷およびその他のストレッサーはp21レベルを増加させますが、マイトジェン刺激ERK2およびAkt活性はp21のリン酸化を不活性化します。

p27の過剰発現に関する初期の研究では、in vitroおよび選択した細胞タイプで、サイクリンD-Cdk4 / 6複合体およびサイクリンE / A-Cdk2複合体と結合して阻害できることが示唆されました。しかし、LaBaerらによる速度論的研究。（1997）p21とp27の滴定がサイクリンd-Cdk複合体のアセンブリを促進し、複合体の全体的な活性と核局在化を増加させることを発見しました。その後の研究では、p27-/-、p21-/-MEFがサイクリンD-Cdk4複合体形成の減少を示し、p27の再発現で救助できるため、サイクリンD-Cdk複合体形成にp27が必要である可能性があることが明らかになりました。

Jamesらによる研究（2008）さらに、サイクリンD-Cdk4 / 6に結合している間、p27のチロシン残基のリン酸化が抑制状態と非抑制状態の間でp27を切り替えることができることを示唆し、p27がサイクリン-Cdk複合体アセンブリとアクティビティ。サイクリンD-Cdk4 / 6とp27の関連付けは、サイクリンE-Cdk2複合体の不活性化に利用可能なp27のプールを制限することにより、細胞周期の進行をさらに促進する可能性があります。後期G1のサイクリンE-Cdk2活性の増加（および早期SのサイクリンA-Cdk2）は、核の輸出、ユビキチン化、および分解を促進するp21 / p27リン酸化をもたらします。

ダイナミクス

2008年にデューク大学のLingchong YouグループとJoe Nevinsグループが発行した論文は、双安定ヒステリシスE2Fスイッチが制限ポイントの根底にあることを実証しました。 E2Fはそれ自身の活性化を促進し、またそれ自身の阻害剤（pRb）の阻害を促進し、双安定システムの確立に重要な（特に）2つのフィードバックループを形成します。この研究の著者は、E2F活性の読み出しとしてE2Fプロモーターの制御下で不安定なGFPシステムを使用しました。血清飢ved細胞をさまざまな血清濃度で刺激し、GFPの読み取り値を単一細胞レベルで記録しました。彼らは、GFPレポーターがオンまたはオフであることを発見しました。これは、分析されたすべての異なる血清レベルでE2Fが完全に活性化または非活性化されたことを示します。 E2Fシステムの履歴依存性を分析したさらなる実験により、それがヒステリシス双安定スイッチとして動作することが確認されました。

がんで

癌は、細胞が継続的かつ不適切に細胞周期に再入し、G0に入らないため、正常な制限点機能の破壊とみなすことができます。制限点に向かう経路の多くのステップでの突然変異は、細胞の癌性増殖を引き起こす可能性があります。がんで最も一般的に変異している遺伝子には、CdkとCKIが含まれます。過活動Cdkまたは低活動CKIは、制限ポイントのストリンジェンシーを低下させ、より多くの細胞が老化をバイパスできるようにします。

制限点は、新薬療法の開発における重要な考慮事項です。通常の生理学的条件下では、すべての細胞増殖は制限点によって規制されています。これは、化学療法治療から非癌性細胞を保護する方法として活用され、使用されます。化学療法薬は通常、急速に増殖している細胞を攻撃します。成長因子受容体阻害剤などの制限ポイントの完了を阻害する薬物を使用することにより、正常細胞の増殖が防止され、したがって化学療法治療から保護されます。