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光退色

光学系では、 光退色 (フェージングと呼ばれることもあります)は、色素または発蛍光団分子の光化学的変化であり、永久に蛍光を発することができません。これは、共有結合の切断またはフルオロフォアと周囲の分子間の非特異的反応によって引き起こされます。共有結合におけるこのような不可逆的な修飾は、フルオロフォアの一重項状態から三重項状態への遷移によって引き起こされます。完全な漂白を達成するための励起サイクルの数は異なります。顕微鏡では、光退色は蛍光分子の観察を複雑にする可能性があります。なぜなら、蛍光分子を刺激して蛍光を発するのに必要な露光によって最終的に破壊されるからです。これは、タイムラプス顕微鏡では特に問題です。

ただし、自己蛍光を消光するために、(主に抗体結合)蛍光分子を適用する前に、光退色を使用することもできます。これは、信号対雑音比の改善に役立ちます。

光退色は、例えばFRAPを介して分子の運動および/または拡散を研究するために利用することもできます。FRAPでは、光退色部位での蛍光の回復を観察することで細胞成分の動きを確認できます。蛍光損失の広がりが細胞内で観察できるように、光退色のラウンドが行われます。

光退色によって引き起こされる活動の損失は、光曝露の強度またはタイムスパンを減らすか、フルオロフォアの濃度を上げるか、入力光の周波数とフォトンエネルギーを減らすか、またはより堅牢なフルオロフォアを使用することで制御できます脱色しにくい(例:シアニン色素、Alexa FluorsまたはDyLight Fluors、AttoDyes、Janelia Dyesなど)。一定の環境では、各吸収-放出サイクルが光退色を引き起こす可能性が等しいため、合理的な概算では、一定の露出(放出の強度X放出時間Xサイクル数)後に特定の分子が破壊されます。

光退色は、生物物理学におけるリアルタイムの単一分子蛍光イメージングを説明する重要なパラメーターです。単一分子蛍光イメージングで使用される光強度(一般的な実験セットアップでは0.1-1kW / cm2)では、ほとんどの堅牢なフルオロフォアでさえ、1ステップで光退色するまで最大10秒間発光し続けます。一部の色素では、酸素除去システムを使用して寿命を10〜100倍に延長できます(イメージングパラメータとS / Nの最適化により最大1000秒)。たとえば、プロトカテク酸(PCA)とプロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ(PCD)の組み合わせは、しばしば酸素捕捉システムとして使用され、蛍光寿命を1分以上延長します。

一生

特定の化学的性質に応じて、分子はほんの数個の光子を吸収した後に光退色する可能性がありますが、より堅牢な分子は破壊する前に多くの吸収/放出サイクルを受けることがあります。

  • 緑色蛍光タンパク質:104〜105光子。 0.1〜1.0秒のライフタイム。
  • 典型的な有機色素:105〜106光子。 1〜10秒のライフタイム。
  • CdSe / ZnS量子ドット:108光子; > 1,000秒のライフタイム。

「寿命」という用語のこの使用は、蛍光寿命イメージングによって測定される「寿命」と混同しないでください。