P要素

P要素は、雑種発育不全と呼ばれる遺伝形質の原因物質としてショウジョウバエで発見された転移可能な要素です。トランスポゾンはP要素のP特性の原因であり、野生のハエにのみ見られます。他の多くの真核生物にも見られます。

P要素は、プロテインPトランスポザーゼをエンコードします。実験室の系統の雌とは異なり、野生型の雌は、まったく同じ要素から、Pトランスポザーゼ機能の阻害剤を発現すると考えられています。この阻害剤は、P要素によって引き起こされるゲノムの破壊を減らし、生殖能力のある子孫を可能にします。これの証拠は、実験室の雌（Pトランスポザーゼ阻害剤を欠く）と野生型の雄（P成分を持つ）の交配から得られます。阻害剤が存在しない場合、P要素はゲノム全体で増殖し、多くの遺伝子を破壊し、子孫を殺します。

P要素は、 ショウジョウバエの遺伝実験で変異原性物質として一般的に使用されています。このアプローチの利点の1つは、突然変異を見つけやすいことです。 dysgenicあることが知られている染色体損傷原因ハイブリッド子孫を産ショウジョウバエの別の株とショウジョウバエの仲間のハイブリッド発育不全で、1つの系統。ハイブリッド発育不全は、両方の親からの貢献を必要とします。たとえば、 PMシステムでは、 P系統が父親に貢献し、 M系統が母親に貢献します。 Mの父とPの母との逆交配は、P x PまたはM x Mの方法で交配するため、正常な子孫を生み出します。 P男性染色体は、M女性と交配すると発育不全を引き起こす可能性があります。

特徴

P要素はクラスIIトランスポゾンであり、DNAベースの「カットアンドペースト」メカニズムによって移動します。シーケンスは、3つのイントロンを持つ4つのエクソンで構成されています。イントロンの完全なスプライシングによりトランスポザーゼ酵素が生成され、イントロン1と2の選択的部分スプライシングによりイントロン3のみが残り、P要素リプレッサーがエンコードされます。完全な自律的P要素は、トランスポザーゼ酵素をエンコードします。これは、P要素の31 bpの末端逆方向反復を認識し、P要素の切除と再挿入を触媒します。完全な要素は2907 bpです。非自律的なP要素には、トランスポザーゼの生産を無効にするさまざまな長さの内部欠失が含まれていますが、トランスポザーゼがゲノムの他の場所にコード化されている場合、そのような要素は依然として動員できます。 Pエレメントの挿入とその後の切除により、8 bpの直接リピートが生成されます。このようなリピートの存在は、以前のPエレメントの活性を示しています。

すべてのP要素は、トランスポザーゼのTHAPドメインに位置する31 bpの末端逆方向反復と11 bpの内部逆方向反復を含む標準構造を持っています。より短いP要素と最も長いP要素は、非自律的な要素です。最も長いP要素は、転位に必要なトランスポザーゼをエンコードします。 P要素はまた、細胞の発達中に細胞質に蓄積する転位の抑制因子をコードします。したがって、PまたはMのオスとPのメスの交配では、メスの細胞質にサプレッサーが含まれ、サプレッサーはすべてのP要素に結合し、それらの転位を防ぎます。

ハイブリッド発育不全

ハイブリッド発育不全とは、自律P要素を持つ男性（P Strain / P細胞型）とP要素を持たない女性（M Strain / M細胞型）の交雑により生じるショウジョウバエ株の生殖細胞における突然変異率が高いことを指します。ハイブリッド発育不全症候群は、温度依存性の不妊、突然変異率の上昇、染色体の再配列と組換えの増加によって特徴付けられます。

ハイブリッド発育不全の表現型は、 P系統のオスとM系統のメスの子孫の生殖細胞系内のP元素の転位の影響を受けます。トランスポザーゼmRNAの作成に必要なスプライシングイベントは体細胞では発生しないため、転位は生殖細胞でのみ発生します。

ハイブリッド発育不全は、P系統のオスとM系統のメスを交配するときに現れ、P系統のメス（自律P要素を持つ女性）とM系統のオスを交配するときではありません。 P系統の雌の卵には、トランスポザーゼ遺伝子の転写を妨げるリプレッサータンパク質が大量に含まれています。リプレッサータンパク質を含まないM系統の母親の卵は、父親の精子からのP元素の転位を可能にします。 P系統の雌では、リプレッサーは細胞質に見られます。したがって、P系統のオスがM系統のメス（細胞質にリプレッサーを含まない）を受精させると、オスはそのゲノムにPエレメントを寄与しますが、P系統の子孫をもたらすオスの細胞質は寄与しません。

この効果は、Pエレメントに対する防御メカニズムを提供する母性系統でのみ継承されるpiRNAに寄与します。

分子生物学での使用

P要素は、 ショウジョウバエの研究で変異原として広く使用されています。突然変異誘発システムは通常、自律的だが不動の要素と、移動する非自律的要素を使用します。その後の世代からのハエは、表現型またはPCRによってスクリーニングすることができます。

自然に発生するP要素には以下が含まれます。

酵素トランスポザーゼのコード配列
トランスポザーゼ作用の認識配列

トランスポザーゼは、ホストDNAからのPエレメントの除去を調節および触媒し、2つの認識部位を切断してからランダムに再挿入する酵素です。遺伝子研究に使用できるのは、既存の遺伝子に干渉したり、追加の遺伝子を運ぶ可能性があるランダムな挿入です。

これを有用で制御可能な遺伝的ツールとして使用するには、制御されない転位を防ぐために、P要素の2つの部分を分離する必要があります。したがって、通常の遺伝的ツールは次のとおりです。

トランスポザーゼ認識配列のないトランスポザーゼをコードするDNA。
「Pプラスミド」

Pプラスミドには常に以下が含まれます。

ショウジョウバエのレポーター遺伝子。多くの場合、赤目マーカー（白い遺伝子の産物）。
トランスポザーゼ認識配列。

以下を含む場合があります：

興味のある遺伝子
大腸菌選択マーカー遺伝子、しばしばある種の抗生物質耐性。
複製起点およびその他の関連するプラスミド「ハウスキーピング」配列。

使用方法

これらのツールを利用するには、主に2つの方法があります。

フライ変換

Pエレメントをプラスミドにクローンし、バクテリアでこれを形質転換および成長させます。
Pトランスポザーゼを除去し、目的の遺伝子に置き換えます。
トランスポザーゼをコードするDNAとレポーター遺伝子、目的の遺伝子、トランスポザーゼ認識配列を含むプラスミドを、初期（細胞化前）胚の後端に微量注入します。
ランダムな転位が発生し、目的の遺伝子とレポーター遺伝子が挿入されます。
目的の遺伝子が挿入されると、それ自身のPトランスポザーゼを産生できないため、もはや可動ではなくなります。
飛ぶと交配して、生物の細胞間の遺伝的変異を取り除きます。（生物の一部の細胞のみが形質転換されます。うまくいけば、これらの形質転換細胞の一部は生殖細胞系列になります。形質転換配偶子は、細胞間で変化のない生物を生じます）。
レポーター遺伝子を発現しているハエを探します。これらは挿入された目的の遺伝子を運ぶので、目的の遺伝子による表現型を決定するために調査することができます。

挿入された遺伝子は、ホストの遺伝子の1つの機能を損傷した可能性があります。ハエの数系統が必要であるため、比較を行い、追加の遺伝子がノックアウトされていないことを確認できます。

挿入変異誘発

トランスポザーゼをコードするDNAとレポーター遺伝子およびトランスポザーゼ認識配列（および多くの場合、 大腸菌レポーター遺伝子および複製起点など）を含むプラスミドを胚に微量注入します。
ランダムな転位が起こり、レポーター遺伝子がランダムに挿入されます。挿入は、活発に転写される遺伝子の近くで発生する傾向があります。これは、クロマチン構造が最も緩い場所であるため、DNAが最もアクセスしやすいためです。
ハエを育てて交配し、生物の細胞間の遺伝的変異を除去します（上記参照）。
レポーター遺伝子を発現しているハエを探します。これらは正常な転位を経験しているので、既存の遺伝子の突然変異による表現型を決定するために調査することができます。

可能な突然変異：

翻訳領域への挿入=>ハイブリッドタンパク質/切断タンパク質。通常、タンパク質の機能が失われますが、より複雑な効果が見られます。
イントロンへの挿入=>変更されたスプライシングパターン/スプライシングの失敗。通常、より複雑な効果が一般的ですが、タンパク質の切断または不活性なミススプライシング製品の生産をもたらします。
5 '（mRNA 5' UTRになる配列）の非翻訳領域=>トランスクリプトの切り捨て。通常、mRNAに5 'キャップが含まれないため、翻訳効率が低下します。
プロモーターへの挿入=>発現の減少/完全な喪失。常にタンパク質生産レベルが大幅に低下します。状況が単純であるため、分析に最も便利なタイプの挿入。
プロモーターと上流エンハンサー間の挿入=>レポーター遺伝子のエンハンサー機能の喪失/エンハンサー機能のハイジャック。†複雑な効果がしばしば見られるが、一般に細胞型に対するタンパク質特異性のレベルを低下させる。

エンハンサートラッピング

別の遺伝子からのエンハンサーのハイジャックにより、そのエンハンサーの機能の分析が可能になります。これは、特にレポーター遺伝子が蛍光タンパク質用である場合、生物全体で変異遺伝子の発現をマッピングするのに役立ち、非常に強力なツールです。遺伝子発現パターンを（時間的および空間的に）見るための便利なツールです。

その他の使用法

これらの方法は逆遺伝学と呼ばれます。逆遺伝学は、DNA配列決定によって得られた特定の遺伝子配列の表現型効果を分析することにより、遺伝子の機能を発見するアプローチです。

突然変異生成物の分析

変異タンパク質の機能が決定されると、以下の方法で挿入に隣接する領域を配列決定/精製/クローン化することが可能です：

逆PCR

ハエのゲノムを分離します。
（レポーター遺伝子を切断しないことが知られている酵素を使用して）軽い消化を行い、数キロベースの断片、挿入およびその隣接DNAを含む断片を与えます。
消化物を自己結紮し（自己結紮を確実にするための低DNA濃度）、環状DNA断片の選択を提供します。いくつかは挿入とその隣接DNAを伴います。
レポーター遺伝子のある時点でプラスミドを切断します（ゲノムDNAを切断することは非常にまれですが、レポーター遺伝子では既知である酵素を使用）。
レポーター遺伝子セクションのプライマーを使用して、DNAを増幅して配列決定することができます。

切断、セルフライゲーション、再切断のプロセスにより、配列を知らなくてもDNAの隣接領域を増幅できます。結紮が発生したポイントは、の切断部位を識別することによって見ることができます。

プラスミドレスキュー

ハエのゲノムを分離します。
プラスミド配列、 大腸菌レポーターでいくつか、数キロベースのフラグメントを与え、（レポーター遺伝子との間の境界および大腸菌レポーター遺伝子およびプラスミド配列に切断することが知られている酵素を用いて）光を消化受けるとその隣接DNA。
消化物を自己連結し（自己連結を確実にするための低DNA濃度）、環状のDNA断片を選択し、いくつかは大腸菌レポーター、プラスミド配列、およびその隣接DNAを使用します。
プラスミドを大腸菌細胞に挿入します（エレクトロポレーションなど）。
大腸菌選択マーカー遺伝子のプラスミドを選択します。プラスミド「ハウスキーピング」配列を持つプラスミドの挿入に成功した場合のみ、この遺伝子が発現します。
遺伝子はさらに分析するためにクローン化できます。