核酸の定量

分子生物学では、核酸の定量が一般的に行われ、混合物中に存在するDNAまたはRNAの平均濃度とその純度が決定されます。核酸を使用する反応では、最適なパフォーマンスを得るために特定の量と純度が必要になることがよくあります。これまで、科学者は溶液中の核酸（DNAやRNAなど）の定量化または濃度の確立に2つの主なアプローチを使用していました。これらは、DNA色素の存在下での分光測光定量とUV蛍光タギングです。

分光測光分析

DNAまたはRNAを定量するために、より一般的に使用されるプラクティスの1つは、分光光度計を使用した分光光度分析の使用です。 分光光度計は、混合物中に存在する核酸DNAまたはRNAの平均濃度、およびそれらの純度を決定できます。

分光光度分析は、核酸が特定のパターンで紫外線を吸収するという原理に基づいています。 DNAとRNAの場合、サンプルは260ナノメートル（nm）の波長の紫外線にさらされ、光検出器はサンプルを通過する光を測定します。紫外線の一部は通過し、一部はDNA / RNAに吸収されます。サンプルに吸収される光が多いほど、サンプル中の核酸濃度は高くなります。その結果、光検出器に当たる光が少なくなり、光学密度（OD）が高くなります

ランベルトベールの法則を使用すると、吸収される光の量を吸収分子の濃度に関連付けることができます。 260 nmの波長では、二本鎖DNAの平均吸光係数は0.020（μg/ ml）-1 cm-1、一本鎖DNAの場合は0.027（μg/ ml）-1 cm-1、単一の-鎖RNAは0.025（μg/ ml）-1 cm-1であり、短い一本鎖オリゴヌクレオチドの場合、長さと塩基組成に依存します。したがって、1の吸光度（A）は、二本鎖DNAの濃度50μg/ mlに相当します。この計算方法は、少なくとも2のAまで有効です。オリゴヌクレオチドには、より正確な吸光係数が必要になる場合があります。これらは、最近傍モデルを使用して予測できます。

計算

光学密度は、方程式から生成されます。

光学密度= Log（入射光の強度/の強度
透過光）

実際には、DNAまたはRNAを含まないサンプルは、
紫外線を吸収するため、ODが0になります

光学密度=ログ（100/100）= 0

DNAまたはRNAの濃度を決定するために分光光度分析を使用する場合、標準曲線を必要とせずに、ランベルトベールの法則を使用して未知の濃度を決定します。本質的に、ビールランバートの法則により、吸収される光の量を吸収分子の濃度に関連付けることができます。以下の吸光度単位から核酸濃度への換算係数を使用して、ODを未知の核酸サンプルの濃度に変換します。

A260 dsDNA = 50 µg / mlA260 ssDNA = 33 µg / mlA260 ssRNA = 40 µg / ml

換算係数

10 mmの光路長を使用する場合は、ODに変換係数を掛けて濃度を決定します。たとえば、OD 2.0のdsDNAサンプルは、濃度が100 ug / mlのサンプルに対応します。

10mmより短い経路長を使用する場合、結果のODは10 /経路長の係数で減少します。上記の例を3 mmの光路長で使用すると、100 ug / mlサンプルのODは0.6に減少します。濃度を10mm相当に正規化するには、次のようにします。

0.6 OD X（10/3）* 50 ug / ml = 100 ug / ml

ほとんどの分光光度計では、結果の濃度がビールの法則の原理に基づいた10 mmの光路長に正規化されるように、核酸の種類と光路長を選択できます。

数量測定としてのA260

「A260ユニット」は、核酸の量の尺度として使用されます。 1 A260ユニットは、1 mLに含まれる核酸の量であり、ODが1になります。同じ変換係数が適用されるため、このような状況では：

1 A260ユニットdsDNA = 50 µg1 A260ユニットssDNA = 33 µg1 A260ユニットssRNA = 40 µg

サンプル純度（260：280/260：230比）

核酸サンプルは、他の分子（タンパク質、有機化合物、その他）で汚染されているのが一般的です。核酸の定量に分光光度分析を使用する2番目の利点は、260 nm：280 nmの計算を使用してサンプルの純度を決定できることです。 260および280 nmでの吸光度の比（A260 / 280）を使用して、核酸の純度を評価します。純粋なDNAの場合、A260 / 280は約1.8と広く考えられていますが、元のWarburg紙の数値エラーにより、60％のタンパク質と40％のDNAの混合物に変換すると主張されています。純粋なRNA A260 / 280の比率は〜2.0です。これらの比率は、タンパク質が280 nmで吸収されるために、核酸分離プロセスから残るタンパク質汚染の量を評価するために一般的に使用されます。

タンパク質（特に、芳香族アミノ酸）は280 nmの光を吸収するため、260 nmと280 nmの吸光度の比率は、タンパク質溶液のDNA汚染を評価するために一般的に使用されます。ただし、その逆は当てはまりません。核酸溶液の260：280比に大きな影響を与えるには、比較的大量のタンパク質汚染が必要です。

260：280比は、タンパク質中の核酸汚染に対して高感度です。

％タンパク質	％核酸	260：280の比率
100	0	0.57
95	5	1.06
90	10	1.32
70	30	1.73

260：230の比率では、核酸中のタンパク質汚染に対する感度が不足しています（RNAの場合、100％のDNAは約1.8です）：

％核酸	％タンパク質	260：230の比率
100	0	2.00
95	5	1.99
90	10	1.98
70	30	1.94

この違いは、タンパク質の質量減衰係数と比較して、260 nmおよび280 nmでの核酸の質量減衰係数がはるかに高いためです。このため、比較的高濃度のタンパク質であっても、タンパク質は260および280の吸光度にほとんど寄与しません。 260：280の比率ではタンパク質の混入を確実に評価することはできませんが、これはDNA量の推定にほとんど誤差をもたらさないことも意味します。

汚染の特定

サンプルスペクトルの検査は、サンプルの純度に問題があることを特定するのに役立ちます。

低測定値高測定値A260 / A230比

炭水化物のキャリーオーバー（多くの場合、植物の問題）。
核酸抽出からの残留フェノール。
残留グアニジン（カラムベースのキットでよく使用されます）。
降水に使用されるグリコーゲン。

汚れた台座でブランク測定を行います。
ブランク測定に不適切なソリューションを使用します。ブランク溶液は、サンプル溶液と同じpHで、同様のイオン強度でなければなりません。例：TEに溶解したサンプルのブランク測定に水を使用すると、260/230比が低くなる場合があります。

A260 / A280比

抽出プロトコルに関連する残留フェノールまたはその他の試薬。
非常に低い濃度（10 ng / ul）の核酸。

核酸抽出からの残留RNA。

*通常、高い260/280純度比は問題を示すものではありません。

その他の一般的な汚染物質

核酸の精製で一般的に使用されるフェノールによる汚染は、定量化の見積もりを大幅に無効にする可能性があります。フェノールは、270 nmのピークと1.2のA260 / 280で吸収します。フェノールで汚染されていない核酸製剤のA260 / 280は約2である必要があります。フェノールによる汚染は、DNA濃度の過大評価に大きく寄与する可能性があります。
230 nmでの吸収は、フェノレートイオン、チオシアン酸塩、およびその他の有機化合物による汚染によって引き起こされる可能性があります。純粋なRNAサンプルの場合、A230：260：280は約1：2：1である必要があり、純粋なDNAサンプルの場合、A230：260：280は約1：1.8：1である必要があります。
330 nm以上での吸収は、微粒子が溶液を汚染し、可視範囲の光を散乱させることを示しています。純粋な核酸サンプルの値はゼロでなければなりません。
不適切なソリューションが空白として使用された場合、負の値が生じる可能性があります。あるいは、これらの値は、溶液中の色素の蛍光により生じる可能性があります。

蛍光色素のタグ付けによる分析

DNAおよびRNA濃度を評価する別の方法は、サンプルに蛍光タグをタグ付けすることです。蛍光タグは、核酸に結合し、結合すると選択的に蛍光を発する色素（臭化エチジウムなど）の強度を測定する蛍光色素です。この方法は、濃度が低すぎて分光測光法で正確に評価できない場合や、260 nmで吸収する汚染物質がその方法による正確な定量を不可能にする場合に役立ちます。 DNAおよびRNAの蛍光定量の利点は、分光光度分析よりも感度が向上することです。ただし、感度の向上には、サンプルあたりの価格が高くなり、サンプル調製プロセスが長くなるという犠牲が伴います。

これにアプローチする主な方法は2つあります。「スポッティング」では、サンプルをアガロースゲルまたはラップに直接置きます。蛍光色素は、アガロースゲルに存在するか、プラスチックフィルム上のサンプルに適切な濃度で添加されます。既知の濃度のサンプルのセットがサンプルと一緒に発見されます。未知のサンプルの濃度は、これらの既知の濃度の蛍光と比較することにより推定されます。あるいは、既知の濃度のいくつかのサンプルと一緒に、サンプルをアガロースまたはポリアクリルアミドゲルに通してもよい。スポットテストと同様に、濃度は蛍光強度と既知のサンプルとの比較により推定されます。

サンプル量がマイクロプレートまたはキュベットを使用するのに十分な大きさである場合、色素がロードされたサンプルも蛍光光度計で定量化できます。最小サンプル量は0.3μlから始まります

これまで、260 nm / 280 nmの分光測光バージョンに類似したDNAサンプルのタンパク質汚染を測定する蛍光法はありません。