ニューロフィブロミン1

ニューロフィブロミン 1（NF1）は、ニューロフィブロミンのために、染色体17 NF1コード、負のRas結合GTPの加水分解を促進することによりRAS / MAPK経路の活性を調節GTPアーゼ活性化タンパク質上に配置されているヒトにおける遺伝子です。 NF1の突然変異率は高く、 NF1の突然変異は細胞増殖制御および神経発達を変化させ、神経線維腫症1型（NF1、von Recklinghausen症候群としても知られる）を引き起こす可能性があります。 NF1の症状には、外観を損なう皮膚神経線維腫（CNF）、カフェオレ色素斑、網状神経線維腫（PN）、骨格欠陥、視神経膠腫、生命を脅かす悪性末梢神経鞘腫瘍（MPNST）、注意欠陥、学習障害およびその他の認知機能が含まれます障害。

遺伝子

NF1は1990年にクローン化され、その遺伝子産物であるニューロフィブロミンは1992年に同定されました。GTPase活性化タンパク質であるニューロフィブロミンは、主にタンパク質Rasを調節します。 NF1は17番染色体の長腕に位置し、位置q11.2 NF1は350 kbのゲノムDNAにまたがり、62個のエクソンを含んでいます。これらのエクソンのうち58個が構成的であり、4個が選択的スプライシングを示しています（9a、10a-2、23a、および28a）。ゲノム配列は、転写開始部位の4,951 bp上流および翻訳開始コドンの5,334 bp上流で始まり、5 'UTRの長さは484 bpです。

NF1のイントロン27b内に存在する3つの遺伝子があります。これらの遺伝子はEVI2B 、 EVI2A 、およびOMGであり、これらは反対の鎖にコードされ、 NF1の反対方向に転写されます。 EVI2AおよびEVI2Bは、マウスの白血病に関連するタンパク質をコードするマウスのEvi-2AおよびEvi-2B遺伝子のヒト相同体です。 OMGは、神経細胞の髄鞘形成中にヒトの中枢神経系で発現する膜糖タンパク質です。

プロモーター

NF1プロモーターの初期の研究では、ヒトとマウスのNF1プロモーターの間に大きな相同性があることがわかりました。主要な転写開始部位と、ヒトとマウスの両方の遺伝子における2つのマイナーな転写開始部位が確認されています。

主要な転写開始点は、翻訳開始部位の484 bp上流です。オープンリーディングフレームの長さは8,520 bpで、翻訳開始部位から始まります。 NF1エクソン1は544 bpの長さで、5 'UTRを含み、ニューロフィブロミンの最初の20アミノ酸をコードします。 NF1プロモーターは、長さ472 bpのCpGアイランド内にあり、43個のCpGジヌクレオチドで構成され、エクソン1の開始まで延びています。このCpGアイランドは、プロモーターの731-bp上流から始まり、 TATAまたはCCATTボックスがその中に見つかりました。コアプロモーター要素は発見されていませんが、Sp1やAP2などのいくつかの転写因子の5 'UTRでコンセンサス結合配列が特定されています。

マウスとヒトの両方のプロモーターの5つの領域のメチル化マップが1999年に公開されました。このマップは、3つの領域（約– 1000、– 3000、および– 4000）が頻繁にメチル化されることを示しましたが、シトシンは転写に近い開始部位はメチル化されていません。メチル化は、Sp1部位とCREB結合部位に機能的に影響を与えることが示されています。 CREB部位は正常なプロモーター活性が生じるために無傷でなければならないことが示されており、Sp1部位でのメチル化はプロモーター活性に影響する可能性があります。

NF1患者由来の組織で近位NF1プロモーター/ 5 'UTRメチル化が分析されました。メチル化の結果としての転写の減少は、体細胞変異と同等の「二次ヒット」メカニズムである可能性があります。腫瘍組織では、正常組織よりも高い頻度でメチル化されることが検出された部位がいくつかあります。これらのサイトは主に近位プロモーター内にあります。ただし、一部は5 'UTRにも存在し、これらの領域のシトシンのメチル化には個人間で大きなばらつきがあります。

3 'UTR

1993年の研究では、マウスNF1 cDNAをヒト転写物と比較し、非翻訳領域とコード領域の両方が高度に保存されていることを発見しました。 3 'UTRの長さによりサイズが異なる2つのNF1ポリアデニル化転写物が存在することが確認されましたが、これはマウス遺伝子で見つかったものと一致しています。

2000年に実施された研究では、転写後遺伝子調節における3 'UTRの関与がNF1転写産物量の空間的および時間的変動に影響を与えるかどうかを調べました。タンパク質に結合すると思われる3 'UTRの5つの領域が見つかりました。そのうちの1つは腫瘍抗原であるHuRです。 HuRは、3 'UTR全体に散在し、転写産物の安定性の負の調節因子であると考えられているAUリッチな要素に結合します。これは、転写後のメカニズムがNF1転写物のレベルに影響を与える可能性があるという考えを支持しています。

突然変異

NF1は既知のヒト遺伝子の中で最も高い突然変異率の1つを持っていますが、そのサイズが大きいこと、偽遺伝子の存在、および考えられるさまざまな突然変異のために、突然変異の検出は困難です。 NF1遺伝子座は、 de novo変異の発生率が高く、これは、変異が母性にも父性にも受け継がれないことを意味します。突然変異率は高いですが、突然変異の「ホットスポット」領域はありません。突然変異は遺伝子内に分布する傾向がありますが、エクソン3、5、および27は突然変異の一般的な部位です。

Human Gene Mutation Databaseには1,347個のNF1変異が含まれていますが、「規制」カテゴリには含まれていません。プロモーターまたは非翻訳領域内で決定的に同定された変異はありません。これは、そのような突然変異がまれであるか、または認識可能な表現型をもたらさないためかもしれません。

スプライシングに影響する変異が特定されており、実際、286の既知の変異がスプライシング変異として特定されています。スプライシング変異の約78％がスプライス部位に直接影響し、異常なスプライシングが発生する可能性があります。異常なスプライシングは、スプライシング調節エレメント内の変異により発生する場合もあります。スプライス部位の外側にあるイントロン変異もスプライシング変異に該当し、スプライシング変異の約5％がこの性質を持っています。スプライシングに影響する点変異は一般的に見られ、これらはしばしば調節配列の置換です。エキソン変異は、エクソン全体の削除、または変異が新しいスプライス部位を作成する場合のエクソンの断片の削除につながる可能性があります。イントロン変異は、不可解なエクソンの挿入をもたらす可能性があり、または変異が保存された3 'または5'末端にある場合、エクソンのスキップをもたらす可能性があります。

タンパク質

NF1は、2,818個のアミノ酸を含む320 kDaのタンパク質であるニューロフィブロミン（NF1）をコードします。ニューロフィブロミンは、Ras結合グアノシン三リン酸（GTP）の加水分解を促進することにより、Ras経路活性を負に調節するGTPase活性化タンパク質（GAP）です。ニューロフィブロミンは細胞質に局在します。ただし、一部の研究では、ニューロフィブロミンまたはその断片が核内で見つかっています。ニューロフィブロミンには、エクソン43によってコードされる核局在化シグナルが含まれていますが、ニューロフィブロミンが核で役割を果たすかどうかは現在不明です。ニューロフィブロミンは遍在的に発現しますが、発現レベルは生物の組織タイプと発達段階によって異なります。発現は、成体ニューロン、シュワン細胞、星状細胞、白血球、および希突起膠細胞で最高レベルです。

ニューロフィブロミンの触媒RasGAP活性は、GAP関連ドメイン（GRD）と呼ばれるタンパク質の中央部分に位置しています。 GRDはRasGAPと密接に相同であり、ニューロフィブロミン配列の約10％（229アミノ酸）に相当します。 GRDは、最小中心触媒ドメイン（GAPc）と呼ばれる中心部分と、N末端およびC末端から約50残基のコイル形成により形成される追加ドメイン（GAPex）で構成されています。 Ras結合領域はGAPcの表面にあり、保存されたアミノ酸残基が並んだ浅いポケットで構成されています。

GRDに加えて、ニューロフィブロミンには、Sec14相同性領域とプレクストリン相同性（PH）ドメインも含まれています。 Sec14ドメインは、ケージに似た脂質結合ポケットによって定義され、リガンドのアクセスを調節すると考えられているらせん状の蓋部分で覆われています。 PHのような領域は、Sec14ドメインにあるらせん状の蓋と相互作用するように伸びるPHコアからの2つのベータストランドを接続する突起を表示します。これら2つの領域間の相互作用の機能は現在不明ですが、構造は、脂質結合ポケットへのリガンドのアクセスを制御するために、らせん構造に影響を与える調節相互作用を意味します。

関数

NF1-GRDドメインを介して、ニューロフィブロミンはRasのGTP加水分解速度を増加させ、Ras活性を低下させることにより腫瘍抑制因子として作用します。 Ras-Nf1複合体が集合すると、活性Rasはニューロフィブロミン触媒ドメインに存在する溝に結合します。この結合は、Rasスイッチ領域IおよびII、およびニューロフィブロミンに存在するアルギニンフィンガーを介して発生します。 Rasとニューロフィブロミンの相互作用により、GTPからGDPへのGAP刺激による加水分解が引き起こされます。このプロセスは、RasスイッチIおよびスイッチII領域の残基の安定化に依存しており、これによりRasは酵素機能に必要な確認が行われます。 Rasとニューロフィブロミンの間のこの相互作用はまた、GDP加水分解の遷移状態が安定することを必要とし、これは正に帯電したアルギニンフィンガーをRas活性部位に挿入することにより実行されます。これにより、ホスホリル転移中にGTPに存在する負電荷が中和されます。 GTPをGDPに加水分解することにより、ニューロフィブロミンはRasを不活性化し、したがってRas経路を負に調節し、アポトーシス、細胞周期、細胞分化または遊走に関与する遺伝子の発現を制御します。

ニューロフィブロミンは、シナプスへのGRIN2Bの輸送に関与するKIF17 / ABPA1 / CASK / LIN7A複合体に関与するタンパク質であるシンデカンを介してCASKと相互作用することも知られています。これは、ニューロフィブロミンがNMDA受容体サブユニットのシナプスとその膜への輸送に役割を果たしていることを示唆しています。ニューロフィブロミンは、アデニリルシクラーゼの調節を通じて、シナプスのATP-PKA-cAMP経路にも関与していると考えられています。また、p21ras、PKC、および成長応答因子を調節するタンパク質であるカベオリン1に結合することも知られています。

アイソフォーム

現在、ニューロフィブロミンには5つの既知のアイソフォーム（II、3、4、9a、および10a-2）があり、これらのアイソフォームは、変化しない選択的スプライシングエキソン（9a、10a-2、23a、および48a）を含めることで生成されます読書枠。これらの5つのアイソフォームは、異なる組織で発現し、それぞれ特定の抗体によって検出されます。

GRD2（ドメインII関連GAP）とも呼ばれるニューロフィブロミンII型は、タンパク質の5 '領域に21アミノ酸の付加を引き起こすエクソン23aの挿入から生じます。ニューロフィブロミンII型はシュワン細胞で発現し、GAP活性が低下しています。

ニューロフィブロミン3型（アイソフォーム3 'ALTとも呼ばれる）には、3'末端に18個のアミノ酸が挿入されるエクソン48aが含まれています。
ニューロフィブロミンタイプ4は、エクソン23aおよび48aを含み、5 '領域に21アミノ酸、3'末端に18アミノ酸が挿入されます。

ニューロフィブロミン9a（9brとも呼ばれる）には、5 '領域に10個のアミノ酸が挿入されるエクソン9aが含まれます。このアイソフォームはニューロンの発現をほとんど示さず、記憶および学習のメカニズムで役割を果たす可能性があります。

エクソン10a-2が挿入されたアイソフォームが研究されており、膜貫通ドメインが導入されています。エキソン10a-2を含めると、5 '領域に15個のアミノ酸が挿入されます。このアイソフォームはほとんどのヒト組織で発現しているため、細胞内膜でハウスキーピング機能を果たしている可能性があります。

異なるアイソフォーム間の発現の量的な違いは、神経線維腫症1型患者の表現型の変動に関連している可能性が示唆されています。

RNA編集

NF1 mRNAには、GRDの前半にmRNAの編集が起こる部位があります。この部位で脱アミノ化が起こり、ヌクレオチド3916でシチジンがウリジンに変換されます。この脱アミノ化はアルギニンコドン（CGA）をインフレーム翻訳停止コドン（UGA）。編集された転写産物が翻訳されると、GRDのN末端が切断されるため、腫瘍抑制因子として機能できないタンパク質が生成されます。 NF1 mRNAの編集サイトは、ApoB編集サイトと高い相同性を持つことが示されており、2本鎖mRNAはApoBホロ酵素による編集を受けます。 NF1 mRNAの編集は、2つの編集サイト間の高い相同性のためにApoBホロ酵素が関与すると考えられていましたが、研究ではこれは当てはまらないことが示されました。 NF1の編集サイトは、ApoBを介したmRNA編集に必要な配列よりも長く、領域には、ApoB編集サイトには存在しない2つのグアニジンが含まれています。

臨床的な意義

NF1の変異は、主に神経線維腫症1型（フォンレックリングハウゼン症候群としても知られるNF1）に関連しています。 NF1は、ヒトで最も一般的な単一遺伝子疾患であり、世界中の2500〜3000人の出生に約1人で発生します。 NF1は常染色体優性疾患ですが、NF1の約半数はde novo変異に起因しています。 NF1は表現型の多様性が高く、同じファミリーのメンバーは同じ変異を持ち、異なる症状と症状の強さを示します。カフェオレスポットはNF1の最も一般的な兆候ですが、その他の症状には虹彩のリッシュ結節、皮膚神経線維腫（CNF ）、網状神経線維腫（PN）、骨格欠損、視神経膠腫、生命を脅かす悪性末梢神経鞘腫瘍（MPNST）、注意欠陥、学習欠陥、およびその他の認知障害。

神経線維腫症I型に加えて、 NF1の変異は、若年性骨髄単球性白血病（JMML）、消化管間質腫瘍（GIST）、ワトソン症候群、星状細胞新生物、褐色細胞腫、乳がんにもつながる可能性があります。

効果的な治療法NF1はまだ存在しません。代わりに、神経線維腫症の人の後には、専門家チームが症状や合併症を管理します。

モデル生物

NF1の生物学に関する多くの知識は、 ショウジョウバエDrosophila melanogaster 、ゼブラフィッシュDanio rerioおよびマウスMus musculusなどのモデル生物から得られました。これらはすべて、ゲノムにNF1オーソログを含みます（線虫CaenorhabditisにはNF1オーソログは存在しません） elegans ）。これらの前臨床モデルに基づいた研究は、神経線維腫症1型に関連する叢状神経線維腫、神経膠腫、MPNSTおよび神経認知障害に関する複数の臨床アッセイがその後開始されたため、すでにその有効性を証明しています。

マウスモデル

1994年に、最初のNF1遺伝子組み換えノックアウトマウスが公開されました： Nf1変異（ Nf1-/- ）のホモ接合性は、発達の初期段階で胎児の致死につながる重度の発達性心臓異常を誘発し、NF1が基本的な役割を果たすことを指摘しました通常の開発。それどころか、Nf1ヘテロ接合動物（ Nf1 +/- ）は生存可能であったが、異なるタイプの腫瘍を形成する素因があった。これらの腫瘍細胞のいくつかでは、ヘテロ接合性の喪失（LOH）の遺伝的事象が観察され、NF1が腫瘍抑制遺伝子として機能することを裏付けています。

Nf1tm1a（KOMP）Wtsiと呼ばれる条件付きノックアウトマウスラインは、病気の動物モデルを生成し、関心のある科学者に配布するためのハイスループット変異誘発プロジェクトであるInternational Knockout Mouse Consortiumプログラムの一部として後に生成されました。オスとメスの動物は、削除の効果を決定するために標準化された表現型スクリーニングを受けました。 26のテストが変異マウスで実施され、4つの重大な異常が観察されました。妊娠中に同定されたホモ接合変異胚の半分以上が死んでおり、別の研究では離乳まで生存していませんでした。残りのテストは、ヘテロ接合変異体の成体マウスで実施されました。女性は異常な毛の循環を示し、男性はB細胞数が減少し、単球細胞数が増加しました。

Nf1ノックアウトマウスの表現型特徴的な表現型ホモ接合体の生存率異常な劣性致死試験異常な受胎能正常な体重正常な不安正常な神経学的評価正常な握力正常なホットプレート正常な変形異常異常な間接熱量測定正常なグルコース耐性試験正常な聴覚脳幹反応正常な体温正常な眼の形態正常臨床化学正常血漿免疫グロブリン正常血液学正常末梢血リンパ球異常小核試験正常心臓重量正常皮膚組織病理正常脳組織病理正常サルモネラ感染正常シトロバクター感染正常すべての検査および分析

他のいくつかのNF1マウスモデルの開発により、例えばソラフェニブ（VEGFR、PDGFR＆RAFキナーゼ阻害剤）およびエベロリムス/ RAD001（mTORC阻害剤）などの標的薬物の治療可能性を試験する前臨床試験の実施も可能になりました。 NF1叢状神経線維腫、MPNSTの場合はシロリムス/ラパマイシン（mTORC阻害剤）、NF1認知障害および学習障害の場合はロバスタチン（HMG-CoAレダクターゼ阻害剤）およびアレクチニブ（ALK阻害剤）の治療。

2013年、 Dhh-Cre; Nf1flox / flox （NF1患者に見られる神経線維腫を発症する）とMx1-Cre; Nf1flox / flox （NF1幼若骨髄単球に見られる骨髄増殖性新生物を発症する）と呼ばれる2つの条件付きノックアウトマウスモデル白血病/ JMML）は、腫瘍進行に対する特定のMEK阻害剤PD032590の効果を研究するために使用されました。阻害剤は、腫瘍退縮および血液学的改善において顕著な反応を示した。これらの結果に基づいて、いくつかの進行した成人腫瘍で以前に使用された経口選択的MEK阻害剤であるセルメチニブを使用して、手術不能なNF1関連叢状神経線維腫の小児を対象にフェーズIおよびフェーズII臨床試験が実施されました。この研究に登録した子どもたちは、過度の毒性作用に悩まされることなく治療を受けたことがあり、治療の72％で治療が部分反応を誘発しました。これらの前例のない有望な結果は、2018年に食品医薬品局（FDA）と欧州医薬品庁の両方で、Selfmetinibに神経線維腫症1型の治療のための希少薬物ステータスを付与するようになりました。数か月後の2019年、FDAは阻害剤に画期的な治療法の指定を付与します。

キイロショウジョウバエ

ショウジョウバエキイロショウジョウバエのヒトNF1（dNF1）のオルソログ遺伝子は1997年に同定され、クローン化されました。この遺伝子はヒトの対応物よりもわずかにコンパクトですが、ハエのゲノムの最大の遺伝子の1つのままです。 2,802のアミノ酸長全体で、ヒトニューロフィブロミンと55％同一および69％類似のタンパク質をコードします。それは、触媒GAP関連ドメイン（GRD）を含むIRA関連の中央セグメントで構成されており、どちらも人間の対応物と非常によく似ています。また、このドメインの上流と下流の両方に、他の保存された領域が存在します。

dNF1は、そのヒトの対応物と同様に、発達中および成人の神経系で主に発現され、主にMAPK RAS / ERKシグナル伝達経路を制御します。

生成されたdNF1のいくつかの変異ヌル対立遺伝子の使用を通じて、その役割は次第に解明されてきました。 dNF1は、生物の成長と全身の大きさ、シナプスの成長、神経筋接合部の機能、概日時計とリズミカルな行動、ミトコンドリア機能、および連想学習と長期記憶を調節するように機能します。大規模な遺伝的および機能的スクリーニングにより、dNF1に関連した欠陥の原因となる優性修飾遺伝子の同定にもつながっています。

興味深いことに、全身サイズの欠損、学習障害、異常なRAS / ERKシグナル伝達もヒトのNF1状態の重要な特徴であり、すべてハエの未分化リンパ腫キナーゼALK-NF1-RAS / ERKシグナル伝達経路の調節不全によるものです。高度に特異的なALK阻害剤を使用した薬理学的治療はハエのこれらの欠陥をすべて修正し、この治療アプローチは後にアレクチニブでマウスを治療することによりNF1の前臨床マウスモデルで成功裏に検証され、有望な治療標的であることを示唆しました。