生物学
モルフォリーノ
モルフォリノは、 モルフォリノオリゴマーおよびホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー （PMO）としても知られ、遺伝子発現を修飾するために分子生物学で使用されるオリゴマー分子（口語的にはオリゴ ）の一種です。その分子構造は、ホスホロジアミデート基を介してリンクされたメチレンモルホリン環の骨格に付着したDNA塩基を持っています。モルホリノは、リボ核酸（RNA）の塩基対合表面の小さな（約25塩基）特定の配列への他の分子のアクセスをブロックします。モルフォリノは、遺伝子機能をノックダウンすることにより、逆遺伝学の研究ツールとして使用されています。
この記事では、核酸アナログであるモルフォリノアンチセンスオリゴマーのみについて説明します。単語「モルフォリノ」は、6員モルホリン環を含む化学物質を指す他の化学名で発生する可能性があります。他のモルホリン含有分子との混同を避けるために、オリゴを説明する場合、「モルフォリノ」はしばしば商品名として大文字で表記されますが、この使用法は科学文献間で一貫していません。モルフォリノオリゴは、特に医学文献では、PMO（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー）と呼ばれることがあります。 Vivo-MorpholinosおよびPPMOは、細胞への侵入を促進するために化学基が共有結合しているMorpholinosの修飾型です。
遺伝子ノックダウンは、細胞が標的タンパク質を作るのを防ぐことにより達成されます。遺伝子発現のノックダウンは、特定のタンパク質の機能について学習する方法です。同様に、タンパク質をコードするRNA転写物から特定のエクソンをスプライシングさせると、そのエクソンによってコードされるタンパク質部分の機能を決定するのに役立ち、タンパク質の活性を完全に破壊することもあります。これらの分子は、マウス、ゼブラフィッシュ、カエル、ウニなどのいくつかのモデル生物の研究に適用されています。モルホリノは、pre-mRNAのスプライシングを変更したり、miRNAの成熟と活性を阻害したりすることもできます。モルフォリノをRNAに標的化し、モルフォリノを細胞に送達するための技術は、最近、雑誌の記事と本の形でレビューされています。
モルフォリノは、バクテリアやウイルスなどの病原体や遺伝病を標的とした医薬品治療薬として開発中です。 Sarepta TherapeuticsのMorpholino薬eteplirsenは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの原因となるいくつかの変異の治療について、米国食品医薬品局から加速承認を受けました。
歴史
モルフォリノオリゴは、AntiVirals Inc.（現在のSarepta Therapeutics）のSummerton（Gene Tools）によって考案され、元々はWellerと共同で開発されました。
構造
モルフォリノは、天然の核酸構造の再設計の産物である合成分子です。通常25塩基長で、標準的な核酸塩基対合によりRNAまたは一本鎖DNAの相補配列に結合します。構造に関しては、モルフォリノスとDNAの違いは、モルフォリノスには標準的な核酸塩基がありますが、これらの塩基はリン酸ではなくホスホロジアミデート基で結合したメチレンモルホリン環に結合していることです。この図は、そこに描かれている2本の鎖の構造を比較しています。1つはRNAで、もう1つはモルフォリノです。陰イオン性リン酸塩を非荷電ホスホロジアミデート基で置き換えると、通常の生理学的pH範囲でのイオン化が排除されるため、生物または細胞のモルフォリノは非荷電分子です。モルフォリノのバックボーン全体は、これらの修飾サブユニットから作られています。
関数
多くのアンチセンス構造タイプ（ホスホロチオエート、siRNAなど）とは異なり、モルホリノは標的RNA分子の分解を引き起こしません。代わりに、モルフォリノは「立体ブロック」により作用し、RNA内の標的配列に結合し、そうでなければRNAと相互作用する可能性のある分子を阻害します。モルホリノオリゴは、胚における特定のmRNA転写物の役割を調べるためによく使用されます。発生生物学者は、モルフォリノオリゴをゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル（Xenopus）、ウニ、メダカ（ F. heteroclitus）の卵または胚に注入し、モルフォント胚を生成するか、モルフォリノを後の発生段階でニワトリ胚に電気穿孔します。適切な細胞質ゾル送達システムにより、モルフォリノは細胞培養に効果的です。オリゴが送達デンドリマーに共有結合しているVivo-Morpholinosは、成体動物または組織培養で全身投与すると細胞に入ります。
真核生物の正常な遺伝子発現
真核生物では、pre-mRNAが核に転写され、イントロンがスプライシングされてから、成熟したmRNAが核から細胞質に輸出されます。リボソームの小サブユニットは通常、mRNAの5 '末端で結合し、そこにさまざまな他の真核生物開始因子が結合して開始複合体を形成します。開始複合体は、開始コドンに到達するまでmRNA鎖に沿ってスキャンし、その後、リボソームの大サブユニットが小サブユニットに付着して、タンパク質の翻訳が開始されます。このプロセス全体は、遺伝子発現と呼ばれます。これは、DNAの塩基配列としてエンコードされた遺伝子の情報がタンパク質の構造に変換されるプロセスです。モルフォリノは、モルフォリノの塩基配列に応じて、スプライシングを変更したり、翻訳をブロックしたり、RNA上の他の機能部位をブロックしたりできます。
翻訳のブロック
メッセンジャーRNA（mRNA）の5 '非翻訳領域に結合したモルフォリノは、5'キャップから開始コドンへのリボソーム開始複合体の進行を妨げる可能性があります。これにより、標的転写産物のコーディング領域の翻訳（「ノックダウン」遺伝子発現と呼ばれる）が防止されます。これは、研究者が特定のタンパク質の機能を知りたい場合に実験的に役立ちます。モルフォリノは、タンパク質の発現をノックダウンし、そのノックダウンが細胞または生物をどのように変化させるかを学ぶ便利な手段を提供します。いくつかのモルホリノは非常に効果的に発現をノックダウンするため、既存のタンパク質の分解後、標的タンパク質はウエスタンブロットで検出できなくなります。
2016年、合成ペプチド結合PMO（PPMO）は、多くの薬剤耐性菌がカルバペネムを破壊するために使用する酵素であるニューデリーメタロベータラクタマーゼの発現を阻害することがわかりました。
pre-mRNAスプライシングの変更
モルフォリノは、スプライス指向性の小さな核リボ核タンパク質（snRNP）複合体がpre-mRNAの鎖上のイントロンの境界でターゲットに結合するのを防ぐか、または求核性アデニン塩基をブロックして防止することにより、pre-mRNAの処理ステップを妨害しますスプライスラリアット構造の形成、またはスプライスサイレンサーやスプライスエンハンサーなどのスプライス制御タンパク質の結合の妨害による。 snRNP U1（ドナー部位）またはU2 / U5（ポリピリミジン部分とアクセプター部位）の結合を妨げると、一般的に成熟mRNAからエクソンが除外され、スプライシングが変更される可能性があります。一部のスプライスターゲットをターゲットにすると、イントロンの包含が生じますが、不可解なスプライスサイトの活性化は、部分的な包含または除外につながる可能性があります。 U11 / U12 snRNPのターゲットもブロックできます。スプライス修飾は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により簡便にアッセイでき、RT-PCR産物のゲル電気泳動後のバンドシフトと見なされます。
その他のアプリケーション：他のmRNAサイトをブロックし、プローブとして使用
モルホリノは、miRNAの活性と成熟をブロックするために使用されています。フルオレセイン特異的抗体と組み合わせたフルオレセイン標識モルホリノは、miRNAへのin situハイブリダイゼーションのプローブとして使用できます。モルホリノは、リボザイム活性をブロックできます。 U2およびU12 snRNP機能はモルフォリノによって阻害されています。タンパク質コーディング領域内の「滑りやすい」mRNA配列を標的としたモルフォリノは、翻訳フレームシフトを誘発する可能性があります。モルフォリノは、RNA編集、ポリAテーリング、転座シーケンスをブロックできます。この多様な標的に対するモルフォリノ活性は、モルフォリノがタンパク質または核酸とmRNAとの相互作用をブロックするための汎用ツールとして使用できることを示唆しています。
特異性、安定性および非アンチセンス効果
モルホリノは、動物の胚系の標準的なノックダウンツールになりました。これは、成体細胞よりも遺伝子発現の範囲が広く、オフターゲット相互作用の影響を強く受けます。単一細胞または少数細胞の段階でカエルまたは魚の胚に最初に注入した後、器官形成および分化のプロセスのほとんどが過ぎた後、観察された表現型が標的遺伝子と一致して、モルホリノ効果を最大5日後に測定できます倒す。無関係な配列を持つコントロールオリゴは通常、胚の表現型に変化をもたらさず、モルホリノオリゴの配列特異性の証拠と非アンチセンス効果の欠如をもたらします。ノックダウンに必要な用量は、同じmRNAを標的とするいくつかのモルフォリノオリゴの同時注入により低減できます。これは、用量依存性のオフターゲットRNA相互作用を低減または排除するための効果的な戦略です。
mRNAのレスキュー実験は、野生型の表現型を胚に回復させ、モルホリノの特異性の証拠を提供することがあります。 mRNAのレスキューでは、モルフォリノに、モルフォリノのタンパク質をコードするmRNAを同時注入します。ただし、レスキューmRNAには5'-UTR（非翻訳領域）が修飾されているため、レスキューmRNAにはモルフォリノのターゲットが含まれていません。レスキューmRNAのコーディング領域は、目的のタンパク質をエンコードします。レスキューmRNAの翻訳は、モルフォリノによってノックダウンされたタンパク質の生産を置き換えます。レスキューmRNAはモルフォリノのオフターゲット遺伝子発現調節により表現型の変化に影響を与えないため、野生型表現型へのこの復帰はモルフォリノ特異性のさらなる証拠です。場合によっては、レスキューRNAの異所性発現により、野生型の表現型の回復が不可能になります。
胚では、モルフォリノをヌル変異体でテストして予期しないRNA相互作用を確認し、野生型胚で使用して急性ノックダウン表現型を明らかにすることができます。ノックダウン表現型は、しばしば変異表現型よりも極端です。変異体では、ヌル遺伝子を失うことの影響は遺伝的補償によって隠されます。
完全に不自然な骨格のため、モルフォリノは細胞タンパク質によって認識されません。ヌクレアーゼはモルホリノを分解せず、血清や細胞でも分解されません。
モルフォリノの最大18％は、中枢神経系の細胞死やゼブラフィッシュ胚の体節組織など、非標的関連の表現型を誘発するようです。これらの効果のほとんどは、p53を介したアポトーシスの活性化によるものであり、実験的なモルフォリノと一緒に抗p53モルフォリノを同時注入することで抑制できます。さらに、Morpholinoノックダウンのp53を介したアポトーシス効果は、別のアンチセンス構造タイプを使用してフェノコピーされ、p53を介したアポトーシスは、ノックダウンオリゴタイプの結果ではなく、標的タンパク質の損失の結果であることが示されています。これらの効果はシーケンス固有であるようです。ほとんどの場合、モルフォリノが非ターゲット効果に関連付けられている場合、4塩基の不一致モルフォリノはこれらの効果を引き起こしません。
モルフォリノの使用に関する懸念の原因は、「オフターゲット」効果の可能性です。観察されたモルフォント表現型が意図したノックダウンによるものか、オフターゲットRNAとの相互作用によるものかは、多くの場合、観察されたモルフォント表現型が予想されるターゲットのノックダウンに起因することを確認する別の実験を実行することで、胚で対処できますこれは、モルフォリノをテストすることにより、変異体株と比較することにより観察された表現型を確認することにより、モルフォント表現型を同じmRNAを標的とする2番目の非重複モルフォリノで再現することにより行うことができます追加の表現型の変化を検出するために、またはドミナントネガティブ法によってヌル変異体バックグラウンドで。上記のように、レスキューmRNAの同時注入による観察された表現型のレスキューは、実行可能な場合、モルフォリノの特異性の信頼できるテストです。
配送
モルフォリノが効果的であるためには、細胞膜を通過して細胞のサイトゾルに送達されなければなりません。細胞質ゾルに一度注入されると、モルフォリノは細胞質ゾルと核の間を自由に拡散します。これは、細胞質の細胞質ゾルへのマイクロインジェクション後に観察されるモルフォリノの核スプライス修飾活性によって示されます。胚、培養細胞、または成体動物への送達には、さまざまな方法が使用されます。マイクロインジェクション装置は通常、胚への送達に使用され、最も一般的には単一細胞または少数細胞段階で注入が行われます。胚送達の代替方法はエレクトロポレーションであり、後期胚段階の組織にオリゴを送達できます。培養細胞への送達の一般的な手法には、Endo-Porterペプチド（モルフォリノをエンドソームから放出させる）、Special Deliveryシステム（市販されなくなった、Morpholino-DNAヘテロ二本鎖およびエトキシ化ポリエチレンイミン送達試薬を使用）、エレクトロポレーションが含まれます、またはスクレイピングロード。
通常、成体組織への送達は困難ですが、未修飾のモルホリノオリゴの有用な取り込みを可能にするシステムがいくつかあります（デュシェンヌ型筋ジストロフィーの筋肉細胞またはバルーン血管形成術中にストレスを受けた血管内皮細胞への取り込みを含む）。それらは組織の細胞間空間を効果的に透過しますが、非共役PMOはIV投与後の健康な組織内のサイトゾルと核空間への分布が制限されています。成体生物における多数の細胞への全身送達は、細胞透過性ペプチドとモルホリノオリゴの共有結合コンジュゲートを使用することによって達成することができ、かつ、毒性は、ペプチド結合体の適度な用量と関連付けられてきたが、それらは、効果的なオリゴ送達のためにインビボで使用されています観察された毒性を引き起こす用量を下回る用量。モルフォリノの末端に付着したオクタグアニジニウムデンドリマーは、血液から細胞質ゾルに修飾オリゴ（Vivo-Morpholinoと呼ばれる）を送達できます。ペプチド複合体やVivo-Morpholinosなどのデリバリー対応モルフォリノは、ウイルス性疾患および遺伝性疾患の治療薬として有望です。
