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遺伝子送達

宿主細胞への外来遺伝物質の導入

遺伝子送達は、DNAやRNAなどの外来遺伝物質を宿主細胞に導入するプロセスです。遺伝物質は、遺伝子発現を誘導するために宿主細胞の核に到達しなければなりません。遺伝子送達を成功させるには、外来遺伝物質が宿主細胞内で安定している必要があり、ゲノムに組み込まれるか、ゲノムとは独立して複製することができます。これには、目的の宿主細胞に侵入し、その細胞のゲノムに導入遺伝子を送達するように設計されたベクターの一部として外来DNAを合成する必要があります。遺伝子送達の方法として利用されるベクターは、組換えウイルスと合成ベクター(ウイルスおよび非ウイルス)の2つのカテゴリに分類できます。

複雑な多細胞真核生物(より具体的にはワイスマニスト)では、導入遺伝子が宿主の生殖細胞に組み込まれている場合、得られた宿主細胞は導入遺伝子をその子孫に渡すことができます。導入遺伝子が体細胞に組み込まれている場合、導入遺伝子は体細胞株、したがって宿主生物にとどまります。

遺伝子送達は、患者の治療結果を促進するために遺伝子を導入またはサイレンシングするための遺伝子治療で必要なステップであり、作物の遺伝子組み換えにも応用されています。さまざまなタイプの細胞および組織に対する遺伝子送達のさまざまな方法があります。

歴史

ウイルスベースのベクターは、トランスジーン発現のツールとして1980年代に登場しました。 1983年、Siegelは、植物の導入遺伝子発現におけるウイルスベクターの使用について説明しましたが、cDNAクローニングによるウイルス操作はまだ利用できませんでした。ワクチンベクターとして使用される最初のウイルスは、1984年にB型肝炎からチンパンジーを保護する方法としてワクシニアウイルスでした。非ウイルス遺伝子の送達は、1943年にAveryらによって初めて報告されました。外因性DNA暴露により細胞表現型の変化を示した人。

方法

遺伝子を宿主細胞に送達するために利用可能なさまざまな方法があります。遺伝子が細菌または植物に送達されるとき、そのプロセスは形質転換と呼ばれ、遺伝子を動物に送達するために使用されるとき、それはトランスフェクションと呼ばれます。これは、動物との関係では形質転換の意味が異なり、癌状態への進行を示しているためです。一部の細菌では、外来DNAを自然に取り込むことができるため、遺伝子を導入する外部の方法は必要ありません。ほとんどの細胞は、細胞膜をDNA透過性にし、DNAを宿主ゲノムに安定的に挿入できるようにするために何らかの介入を必要とします。

ケミカル

化学ベースの遺伝子送達法では、天然または合成化合物を使用して、細胞への遺伝子の導入を促進する粒子を形成できます。これらの合成ベクターには、DNAまたはRNAを静電的に結合し、遺伝情報を圧縮してより大きな遺伝的伝達に対応する能力があります。化学ベクターは通常、エンドサイトーシスによって細胞に入り、遺伝物質を分解から保護できます。

熱ショック

最も簡単な方法の1つは、セルの環境を変更し、熱ショックを与えることでセルにストレスをかけることです。通常、細胞は、熱パルスにさらされる前に、寒冷条件下で二価カチオン(多くの場合、塩化カルシウム)を含む溶液中でインキュベートされます。塩化カルシウムは細胞膜​​を部分的に破壊するため、組換えDNAが宿主細胞に侵入します。寒冷条件下で細胞を二価陽イオンにさらすと、細胞表面構造が変化または弱まり、DNA透過性が高まることが示唆されています。熱パルスは、細胞膜全体に熱的不均衡を生じさせ、細胞の孔または損傷した細胞壁のいずれかを介してDNAを細胞に押し込むと考えられています。

リン酸カルシウム

別の簡単な方法では、リン酸カルシウムを使用してDNAを結合し、培養細胞にさらします。溶液はDNAとともに細胞に取り込まれ、少量のDNAをゲノムに組み込むことができます。

リポソームとポリマー

リポソームとポリマーは、DNAを細胞に送達するためのベクターとして使用できます。正に帯電したリポソームは負に帯電したDNAと結合しますが、DNAと相互作用するポリマーを設計できます。それらはそれぞれリポプレックスとポリプレックスを形成し、これらは細胞に取り込まれます。 2つのシステムを組み合わせることもできます。ポリマーベースの非ウイルスベクターは、ポリマーを使用してDNAと相互作用し、ポリプレックスを形成します。

ナノ粒子

工学的無機および有機ナノ粒子の使用は、遺伝子送達のための別の非ウイルスアプローチです。

物理的

人工遺伝子送達は、力を使用して細胞膜を介して遺伝物質を導入する物理的方法によって媒介されます。

エレクトロポレーション

エレクトロポレーションは、能力を促進する方法です。 10〜20 kV / cmの電界で細胞に短時間ショックを与えます。これは、プラスミドDNAが入る細胞膜に穴を開けると考えられています。感電後、細胞の膜修復メカニズムによって穴が急速に閉じられます。

バイオリスティックス

植物細胞を形質転換するのに使用される別の方法は、金またはタングステンの粒子をDNAでコーティングした後、若い植物細胞または植物胚に発射するバイオリスティックです。一部の遺伝物質が細胞に入り、細胞を形質転換します。この方法は、 アグロバクテリウム感染の影響を受けにくい植物に使用でき、植物色素体の形質転換も可能にします。植物細胞は、電気穿孔法を使用して形質転換することもできます。電気穿孔法は、電気ショックを使用して、細胞膜をプラスミドDNAに対して透過性にします。細胞およびDNAに引き起こされる損傷のために、微粒子銃およびエレクトロポレーションの形質転換効率は、アグロバクテリウム形質転換よりも低くなります。

マイクロインジェクション

マイクロインジェクションとは、細胞の核膜を通してDNAを直接核に注入することです。

ソノポレーション

ソノポレーションは音波を使用して細胞膜に細孔を作り、遺伝物質の侵入を可能にします。

フォトポレーション

光穿孔とは、レーザーパルスを使用して細胞膜に細孔を作り、遺伝物質の侵入を可能にすることです。

磁気感染

Magnetofectionは、DNAと複合した磁性粒子を使用し、外部磁場は核酸粒子を標的細胞に集中させます。

ハイドロポレーション

流体力学的毛細管効果を使用して、細胞透過性を操作できます。

アグロバクテリウム

植物では、植物細胞への遺伝物質の自然な挿入を可能にするアグロバクテリウムのT-DNAシーケンスを利用して、 アグロ バクテリウムを介した組換えを使用してDNAが挿入されることがよくあります。植物組織は小片に切断され、懸濁したアグロバクテリウムを含む液体に浸されます。バクテリアは、カットによって露出される植物細胞の多くに付着します。細菌は接合を使用して、T-DNAと呼ばれるDNAセグメントをプラスミドから植物に移します。転送されたDNAは植物細胞核にパイロットされ、宿主植物のゲノムDNAに組み込まれます。プラスミドT-DNAは、宿主細胞のゲノムに半ランダムに組み込まれます。

目的の遺伝子を発現するようにプラスミドを変更することにより、研究者は選択した遺伝子を植物ゲノムに安定して挿入できます。 T-DNAの唯一の重要な部分は、2つの小さな(25塩基対)ボーダーリピートであり、そのうち少なくとも1つは植物の形質転換に必要です。植物に導入される遺伝子は、プラスミドのT-DNA領域を含む植物形質転換ベクターにクローン化されます。別の方法はアグロインフィルトレーションです。

ウイルス送達

ウイルス媒介遺伝子送達は、ウイルスが宿主細胞内にそのDNAを注入する能力を利用し、ウイルス自身の遺伝物質を複製および実装する能力を利用します。遺伝子送達のウイルス法は免疫応答を誘発する可能性が高いですが、それらは高い効率を持っています。形質導入は、宿主細胞へのDNAのウイルス媒介挿入を記述するプロセスです。ウイルスの構造は、宿主細胞の核に送達するDNAのリソソームによる分解を防ぐため、ウイルスは遺伝子送達の特に効果的な形態です。遺伝子治療では、送達を目的とする遺伝子を複製欠損ウイルス粒子にパッケージングして、ウイルスベクターを形成します。現在までに遺伝子治療に使用されているウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルスなどがあります。ただし、ウイルスを使用して遺伝子を細胞に送達することには欠点があります。ウイルスは非常に小さなDNA片のみを細胞に送達することができ、それは労働集約的であり、ランダム挿入部位、細胞毒性効果、および突然変異誘発のリスクがあります。

ウイルスベクターベースの遺伝子送達は、ウイルスベクターを使用して遺伝物質を宿主細胞に送達します。これは、目的の遺伝子を含むウイルスを使用して、感染性のあるウイルスゲノムの一部を削除することによって行われます。ウイルスは遺伝物質を宿主細胞の核に送達するのに効率的であり、これは複製に不可欠です。

RNAベースのウイルスベクター

RNAベースのウイルスは、感染性RNA転写産物から直接転写できるため開発されました。 RNAベクターは、プロセッシングが必要ないため、迅速に発現され、標的の形で発現されます。遺伝子の統合は長期的な導入遺伝子の発現につながりますが、RNAベースの送達は通常一時的であり、永続的ではありません。レトロウイルスベクターには、オンコレトロウイルス、レンチウイルス、およびヒトフォーミーウイルスが含まれます。

DNAベースのウイルスベクター

DNAベースのウイルスベクターは通常、ゲノムに組み込まれる可能性があるため、より長く持続します。 DNAベースのウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルスが含まれます。

用途

遺伝子治療

遺伝子送達を促進するために使用されるいくつかの方法は、治療目的での用途があります。遺伝子治療は遺伝子送達を利用して、細胞内の疾患または状態を治療する目的で遺伝物質を送達します。治療環境での遺伝子送達では、適切な量の導入遺伝子発現を送達して所望の効果を引き起こすことができる細胞特異性のある非免疫原性ベクターを利用します。

ゲノミクスの進歩により、さまざまな新しい方法と遺伝子ターゲットを可能性のある用途向けに特定することが可能になりました。さまざまな次世代シーケンシングで使用されるDNAマイクロアレイは、遺伝子発現パターンを調べる分析ソフトウェアと、機能を特定するモデル種のオーソロガス遺伝子を使用して、数千の遺伝子を同時に特定できます。これにより、遺伝子治療で使用するためのさまざまなベクターを特定することができました。新しいクラスのワクチンを作成する方法として、遺伝子送達を利用してハイブリッド生合成ベクターを生成し、可能なワクチンを送達しました。このベクターは、 大腸菌を合成ポリマーと組み合わせてプラスミドDNAを維持しながら、標的細胞のリソソームによる分解を回避する能力を高めたベクターを作成することにより、遺伝子送達に対する従来の障壁を克服します。