ゲル電気泳動

ゲル電気泳動は、サイズ（大きさ）と電荷（電荷）に基づいて、高分子（DNA、RNA、タンパク質）およびその断片を分離および分析する方法です。電荷またはサイズ（IEFアガロース、本質的にサイズに依存しない）でタンパク質を分離する臨床化学で使用され、DNAおよびRNAフラグメントの混合集団を長さで分離する生化学および分子生物学で、DNAおよびRNAフラグメントのサイズを推定するか、または電荷によってタンパク質を分離します。

核酸分子は、電界を印加して負に帯電した分子をアガロースまたは他の物質のマトリックスを通して移動させることにより分離されます。短い分子はゲルの細孔をより簡単に移動するため、長い分子よりも速く移動し、遠くに移動します。この現象はふるいと呼ばれます。タンパク質のふるいにはゲルの細孔が大きすぎるため、タンパク質はアガロースで電荷によって分離されます。ゲル電気泳動は、ナノ粒子の分離にも使用できます。

ゲル電気泳動では、電気泳動中の逆対流媒体またはふるい媒体としてゲルを使用します。これは、電場内の荷電粒子の動きです。ゲルは、電界の印加によって引き起こされる熱対流を抑制し、分子の通過を遅らせるふるい媒体としても機能します。ゲルは、電気泳動後の染色を適用できるように、単に分離の完了を維持するのにも役立ちます。 DNAゲル電気泳動は通常、分析目的で行われ、多くの場合、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるDNAの増幅後に行われますが、質量分析、RFLP、PCR、クローニング、DNAシーケンシングなどの他の方法を使用する前の準備技術として使用できます、またはさらなる特徴付けのためのサザンブロッティング。

物理的基礎

簡単に言えば、電気泳動はサイズに基づいて分子を分類できるプロセスです。電界を使用して、分子（DNAなど）をアガロースまたはポリアクリルアミドでできたゲル内を移動させることができます。電界は、ゲルを介して分子を押す一端の負電荷と、ゲルを介して分子を引っ張る他端の正電荷で構成されています。分類される分子は、ゲル材料のウェルに分注されます。ゲルを電気泳動チャンバーに入れ、電気泳動チャンバーを電源に接続します。電流が印加されると、大きな分子はゲルをゆっくりと移動し、小さな分子はより速く移動します。サイズの異なる分子は、ゲル上で明確なバンドを形成します。

この場合の「ゲル」という用語は、ターゲット分子を封じ込めてから分離するために使用されるマトリックスを指します。ほとんどの場合、ゲルは架橋ポリマーであり、その組成と多孔性は、分析するターゲットの特定の重量と組成に基づいて選択されます。タンパク質または小さな核酸（DNA、RNA、またはオリゴヌクレオチド）を分離する場合、ゲルは通常、異なる濃度のアクリルアミドと架橋剤で構成され、ポリアクリルアミドの異なるサイズのメッシュネットワークを生成します。より大きな核酸（数百塩基以上）を分離する場合、好ましいマトリックスは精製アガロースです。どちらの場合も、ゲルは固体でありながら多孔質のマトリックスを形成します。ポリアクリルアミドとは対照的に、アクリルアミドは神経毒であり、中毒を避けるために適切な安全予防措置を使用して処理する必要があります。アガロースは、架橋のない非荷電炭水化物の長い非分岐鎖で構成されており、高分子と高分子複合体の分離を可能にする大きな細孔を持つゲルをもたらします。

電気泳動とは、ゲルマトリックスを介して分子を移動させるために使用される起電力（EMF）のことです。分子をゲルのウェルに配置し、電界をかけると、分子は異なる速度でマトリックスを移動します。これは、すべての種の電荷質量比（Z）が均一な場合の質量によって大きく決まります。ただし、電荷がすべて均一ではない場合、電気泳動手順によって生成された電界により、電荷に応じて分子が異なって移動します。正味に正に帯電した種は負に帯電したカソードに向かって移動します（これはガルバニ電池ではなく電解質であるため）。一方、正に負に帯電した種は正に帯電したアノードに向かって移動します。質量は、これらの不均一に帯電した分子がマトリックスを介してそれぞれの電極に向かって移動する速度の要因のままです。

複数のサンプルがゲル内の隣接するウェルにロードされている場合、それらは個々のレーンで並行して実行されます。異なる分子の数に応じて、各レーンは、元の混合物からの成分の分離を、成分ごとに1つのバンドとして1つ以上の異なるバンドとして示します。コンポーネントの不完全な分離は、重複するバンド、または複数の未解決のコンポーネントを表す区別できないスミアにつながる可能性があります。最上部から同じ距離にある異なるレーンのバンドには、同じ速度でゲルを通過した分子が含まれています。これは通常、ほぼ同じサイズであることを意味します。既知のサイズの分子の混合物を含む分子量サイズマーカーがあります。そのようなマーカーが未知のサンプルと平行してゲルの1つのレーンで実行された場合、観測されたバンドを未知のサンプルのバンドと比較して、サイズを決定できます。バンドが移動する距離は、分子のサイズの対数にほぼ反比例します。

電気泳動技術には制限があります。ゲルに電流を流すと加熱するため、電気泳動中にゲルが溶けることがあります。電気泳動は緩衝液中で行われ、電界によるpHの変化を低減します。これはDNAとRNAの電荷がpHに依存するため重要ですが、長すぎると溶液の緩衝能力を使い果たす可能性があります。特に未知のタンパク質の分子量を見つけようとする場合、SDS-PAGEによる分子量の決定にも制限があります。最小化が困難または不可能な特定の生物学的変数があり、電気泳動に影響を与える可能性があります。そのような要因には、タンパク質構造、翻訳後修飾、およびアミノ酸組成が含まれます。たとえば、トロポミオシンは、SDS-PAGEゲル上で異常に移動する酸性タンパク質です。これは、酸性残基が負に帯電したSDSによって反発され、不正確な質量電荷比と移動を引き起こすためです。さらに、形態学的またはその他の理由により、遺伝物質の異なる調製物が互いに一貫して移動しない場合があります。

ゲルの種類

最も一般的に使用されるゲルの種類は、アガロースおよびポリアクリルアミドゲルです。各タイプのゲルは、さまざまなタイプとサイズの分析物に適しています。ポリアクリルアミドゲルは通常タンパク質に使用され、DNAの小さな断片（5〜500 bp）に対して非常に高い分解能を持ちます。一方、アガロースゲルはDNAの分解能が低いが分離範囲が広いため、通常50-20,000 bpのサイズのDNAフラグメントに使用されますが、パルスフィールドゲル電気泳動（PFGEで6 Mb以上の分解能が可能です）。ポリアクリルアミドゲルは垂直構成で実行されますが、アガロースゲルは通常、海底モードで水平に実行されます。また、化学重合反応でポリアクリルアミドが形成される一方で、アガロースが熱的に硬化するため、それらの鋳造方法も異なります。

アガロース

アガロースゲルは、海藻から抽出された天然多糖ポリマーから作られています。アガロースゲルは、他のマトリックスと比較してキャストおよび取り扱いが容易です。これは、ゲルの設定が化学的変化ではなく物理的変化であるためです。サンプルも簡単に回収できます。実験終了後、得られたゲルは冷蔵庫のビニール袋に保存できます。

アガロースゲルは均一なポアサイズではありませんが、200 kDaを超えるタンパク質の電気泳動に最適です。アガロースゲル電気泳動は、50塩基対から数メガベース（数百万塩基）の範囲のDNAフラグメントの分離にも使用できます。異なる長さのDNAバンド間の距離は、ゲル内のパーセントアガロースの影響を受けます。パーセンテージが高いほど、実行時間が長くなり、場合によっては数日かかります。代わりに、高濃度のアガロースゲルをパルスフィールド電気泳動（PFE）またはフィールド反転電気泳動で泳動する必要があります。

「ほとんどのアガロースゲルは、電気泳動バッファーに溶解した0.7％（5〜10kbの大きなDNA断片の良好な分離または分離）〜2％（0.2〜1kbの小さな断片の良好な分離）で作られています。非常に小さな断片を分離しますが、この場合には垂直ポリアクリルアミドゲルがより適切です。低パーセンテージのゲルは非常に弱く、持ち上げようとすると壊れる可能性があります。高パーセンテージのゲルはしばしば脆く、均一に固まりません。多くのアプリケーション。」

ポリアクリルアミド

ポリアクリルアミドゲルにより均一な孔径が得られるため、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）は、5から2,000 kDaのサイズのタンパク質の分離に使用されます。ポアサイズは、ゲルの作成に使用されるアクリルアミドとビスアクリルアミドパウダーの濃度を調整することにより制御されます。このタイプのゲルを作成するときは、アクリルアミドが液体および粉末状の強力な神経毒であるため、注意が必要です。

Maxam-GilbertまたはSangerメソッドなどの従来のDNAシーケンス技術では、ポリアクリルアミドゲルを使用して、長さが1塩基対異なるDNAフラグメントを分離し、シーケンスを読み取れるようにしました。最近のほとんどのDNA分離方法では、特に小さなDNAフラグメントを除き、アガロースゲルを使用しています。現在、免疫学およびタンパク質分析の分野で最も頻繁に使用されており、異なるタンパク質または同じタンパク質のアイソフォームを別々のバンドに分離するためによく使用されます。これらをニトロセルロースまたはPVDFメンブレンに転写して、ウェスタンブロットなどで抗体および対応するマーカーでプローブできます。

通常、分解ゲルは6％、8％、10％、12％、または15％で作成されます。スタッキングゲル（5％）を分解ゲルの上に注ぎ、ゲルのくし（ウェルを形成し、タンパク質、サンプルバッファー、ラダーを配置するレーンを定義します）を挿入します。選択される割合は、サンプルで同定またはプローブするタンパク質のサイズによって異なります。既知の重みが小さいほど、使用する割合が高くなります。ゲルの緩衝系の変化は、非常に小さなサイズのタンパク質をさらに分離するのに役立ちます。

澱粉

部分的に加水分解されたジャガイモ澱粉は、タンパク質電気泳動用の別の非毒性培地になります。ゲルは、アクリルアミドまたはアガロースよりもわずかに不透明です。非変性タンパク質は、電荷とサイズに応じて分離できます。 Napthal BlackまたはAmido Black染色を使用して視覚化されます。典型的な澱粉ゲル濃度は5％から10％です。

ゲル条件

変性

変性ゲルは、分析物の自然な構造を破壊し、分析物を線状鎖に広げる条件下で実行されます。したがって、各高分子の移動度は、その線形の長さとその質量電荷比のみに依存します。したがって、生体分子構造の二次、三次、および四次レベルが破壊され、分析される一次構造のみが残ります。

核酸はしばしばバッファーに尿素を含めることで変性しますが、タンパク質は通常SDS-PAGEプロセスの一部としてドデシル硫酸ナトリウムを使用して変性します。タンパク質を完全に変性させるには、3次および4次構造を安定化させる共有ジスルフィド結合を減らすことも必要です。これはPAGEの削減と呼ばれる方法です。還元条件は通常、β-メルカプトエタノールまたはジチオトレイトールの添加により維持されます。タンパク質サンプルの一般的な分析では、PAGEを減らすことがタンパク質電気泳動の最も一般的な形式です。

RNAの分子量を適切に推定するには、変性条件が必要です。 RNAはDNAよりも分子内相互作用を形成することができ、その結果電気泳動の移動度が変化する可能性があります。尿素、DMSO、およびグリオキサールは、RNA構造を破壊するために最も頻繁に使用される変性剤です。もともと、非常に毒性の高い水酸化メチル水銀は、変性RNA電気泳動によく使用されていましたが、一部のサンプルでは選択の方法かもしれません。

変性ゲル電気泳動は、DNAおよびRNAバンディングパターンベースの方法である温度勾配ゲル電気泳動（TGGE）および変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）で使用されます。

ネイティブ

天然ゲルは非変性条件で泳動されるため、分析物の自然な構造が維持されます。これにより、折り畳まれたまたは組み立てられた複合体の物理的なサイズが移動性に影響を与え、生体分子構造の4つのレベルすべての分析が可能になります。生体試料の場合、界面活性剤は、細胞内の脂質膜を溶解するのに必要な範囲でのみ使用されます。複合体は、ほとんどの場合、セル内にあるように関連付けられ、折りたたまれたままです。ただし、分子の形状とサイズが移動度にどのように影響するかを予測することは困難であるため、複合体はきれいにまたは予測どおりに分離されない可能性があります。この問題に対処して解決することは、ネイティブPAGEの定量的な目的です。

変性法とは異なり、ネイティブゲル電気泳動では荷電変性剤を使用しません。したがって、分離される分子（通常はタンパク質または核酸）は、分子量と固有電荷だけでなく断面積も異なるため、構造全体の形状に応じて異なる電気泳動力が発生します。タンパク質の場合、それらはネイティブ状態のままなので、一般的なタンパク質染色試薬だけでなく、特定の酵素結合染色によっても視覚化できます。

ネイティブゲル電気泳動の特定の実験例は、タンパク質の精製中にサンプル中の酵素の存在を確認するために酵素活性をチェックすることです。たとえば、タンパク質アルカリホスファターゼの場合、染色溶液は、トリスバッファー中の4-クロロ-2-2メチルベンゼンジアゾニウム塩と3-ホスホ-2-ナフトエ酸-2'-4'-ジメチルアニリンの混合物です。この染色は、ゲルを染色するためのキットとして市販されています。タンパク質が存在する場合、反応のメカニズムは次の順序で発生します。それは、アルカリホスファターゼによる3-ホスホ-2-ナフトエ酸-2'-4'-ジメチルアニリンの脱リン酸化から始まります（水が必要です反応のため）。リン酸基が放出され、水からアルコール基に置き換えられます。求電子試薬4-クロロ-2-2メチルベンゼンジアゾニウム（ファストレッドTRジアゾニウム塩）は、アルコール基を置換し、最終生成物のレッドアゾ染料を形成します。その名前が示すように、これは反応の最終的な可視赤色生成物です。学部生のタンパク質精製の実験では、結果を視覚化し、精製が成功したかどうかを結論付けるために、通常、市販の精製サンプルの隣にゲルを流します。

ネイティブゲル電気泳動は、通常、プロテオミクスおよびメタロミクスで使用されます。ただし、ネイティブPAGEは、一本鎖のコンフォメーション多型のように、未知の突然変異の遺伝子（DNA）をスキャンするためにも使用されます。

バッファ

ゲル電気泳動のバッファーは、電流を運ぶイオンを提供し、pHを比較的一定の値に維持するために使用されます。これらの緩衝液には大量のイオンが含まれており、これらの緩衝液は電気を通すために必要です。蒸留水やベンゼンなどにはイオンがほとんど含まれていないため、電気泳動での使用には適していません。電気泳動に使用されるバッファーは多数あります。最も一般的なのは、核酸Tris / Acetate / EDTA（TAE）、Tris / Borate / EDTA（TBE）です。他の多くのバッファーが提案されています。例えば、Pubmed citations（LB）、等電ヒスチジン、pKマッチドグッズバッファーなどに基づいて、ほとんど使用されないホウ酸リチウムです。ほとんどの場合、理論的根拠は低電流（熱が少ない）に適合したイオン移動度であり、これによりバッファー寿命が長くなります。ホウ酸塩には問題があります。ホウ酸塩は重合するか、RNAに見られるようなシスジオールと相互作用します。 TAEのバッファリング容量は最も低くなりますが、より大きなDNAに対して最高の解像度が得られます。これは、より低い電圧とより長い時間ですが、より良い製品を意味します。 LBは比較的新しく、5 kbpを超えるフラグメントの解決には効果がありません。ただし、導電率が低いため、はるかに高い電圧（最大35 V / cm）を使用できるため、通常の電気泳動の分析時間が短くなります。導電率が非常に低い培地（1 mMホウ酸リチウム）を含む3％アガロースゲルで、1塩基対のサイズの違いを解消できます。

ほとんどのSDS-PAGEタンパク質分離は、ゲル内のバンドのシャープネスを大幅に向上させる「不連続」（またはDISC）バッファーシステムを使用して実行されます。不連続ゲルシステムでの電気泳動中に、電気泳動の初期段階でイオン勾配が形成され、等速電気泳動と呼ばれるプロセスですべてのタンパク質が単一の鋭いバンドに集中します。サイズによるタンパク質の分離は、ゲルの下部の「分解」領域で達成されます。分解ゲルは通常、はるかに小さい孔径を持ち、これがふるい効果につながり、タンパク質の電気泳動移動度を決定します。

可視化

電気泳動が完了したら、ゲル内の分子を染色して目に見えるようにします。 DNAは、エチジウムブロマイドを使用して可視化できます。これは、DNAにインターカレートされると、紫外線下で蛍光を発しますが、タンパク質は銀染色またはクーマシーブリリアントブルー染料を使用して可視化できます。他の方法を使用して、ゲル上の混合物の成分の分離を視覚化することもできます。分離する分子に放射能が含まれている場合、たとえばDNAシーケンシングゲルの場合、ゲルのオートラジオグラムを記録できます。多くの場合、Gel Docシステムを使用して、ゲルの写真を撮影できます。

下流処理

分離後、等電点電気泳動やSDS-PAGEなどの追加の分離方法を使用できます。次に、ゲルを物理的に切断し、タンパク質複合体を各部分から別々に抽出します。次に、ペプチドマスフィンガープリンティングやゲル内消化後の新規ペプチドシーケンスなどにより、各抽出物を分析できます。これにより、複合体のタンパク質のアイデンティティに関する多くの情報を提供できます。

用途

クローン化されたDNAの制限マッピングなど、制限酵素消化後のDNA分子のサイズの推定。
PCR産物の分析（分子遺伝学的診断や遺伝子フィンガープリンティングなど）
サザントランスファー前の制限ゲノムDNA、またはノーザントランスファー前のRNAの分離。

ゲル電気泳動は、法医学、分子生物学、遺伝学、微生物学、および生化学で使用されます。結果は、UV光とゲルイメージングデバイスでゲルを視覚化することで定量的に分析できます。画像はコンピューター操作のカメラで記録され、対象のバンドまたはスポットの強度が測定され、同じゲルにロードされた標準またはマーカーと比較されます。測定と分析のほとんどは、専用のソフトウェアで行われます。

実行される分析の種類に応じて、ゲル電気泳動の結果と組み合わせて他の技術が実装されることが多く、幅広い分野固有のアプリケーションを提供します。

核酸

核酸の場合、負の電極から正の電極への移動の方向は、糖リン酸骨格によって運ばれる自然に発生する負の電荷によるものです。

二本鎖DNAフラグメントは自然に長いrod状体として振る舞うため、ゲルを通るそれらの移動は、そのサイズ、または環状フラグメントの場合は回転半径に関連しています。しかし、プラスミドなどの環状DNAは複数のバンドを示す場合があり、移動の速度は、リラックスしているかスーパーコイルになっているかによって異なります。一本鎖DNAまたはRNAは複雑な形状の分子に折りたたまれ、三次構造に基づいて複雑な方法でゲル内を移動する傾向があります。そのため、水酸化ナトリウムやホルムアミドなどの水素結合を破壊する薬剤を使用して、核酸を変性させ、再び長いロッドのように動作させます。

大きなDNAまたはRNAのゲル電気泳動は、通常、アガロースゲル電気泳動によって行われます。ポリアクリルアミドDNAシーケンスゲルの例については、「連鎖停止方法」ページを参照してください。核酸またはフラグメントのリガンド相互作用による特性評価は、移動度シフト親和性電気泳動によって実行できます。

RNAサンプルの電気泳動を使用して、ゲノムDNAの混入やRNAの分解を確認できます。真核生物からのRNAは、28sおよび18s rRNAの明確なバンドを示し、28sバンドは18sバンドの約2倍の強度です。分解されたRNAのバンドは明確に定義されておらず、外観が不鮮明で、強度比は2：1未満です。

たんぱく質

タンパク質は、核酸とは異なり、さまざまな電荷と複雑な形状を持っている可能性があるため、サンプルに負から正のEMFを配置した場合、同じ速度でポリアクリルアミドゲルに移行することはありません。したがって、タンパク質は通常、タンパク質を負電荷でコーティングするドデシル硫酸ナトリウム（SDS）などの界面活性剤の存在下で変性します。一般に、結合するSDSの量はタンパク質のサイズに比例するため（通常、タンパク質1グラムあたり1.4g SDS）、結果として生じる変性タンパク質は全体的に負の電荷を持ち、すべてのタンパク質は同様の電荷対質量を持ちます比率。変性タンパク質は複雑な三次形状を持つ代わりに長いlike状体のように作用するため、得られるSDSコーティングされたタンパク質がゲル内を移動する速度はそのサイズのみに関係し、電荷や形状には関係しません。

タンパク質は通常、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、ネイティブゲル電気泳動、分取ゲル電気泳動（QPNC-PAGE）、または2D電気泳動によって分析されます。

リガンド相互作用による特性評価は、エレクトロブロッティング、アガロースのアフィニティー電気泳動、または結合定数の推定およびレクチン結合によるグリカン含有量などの構造的特徴の決定に関するキャピラリー電気泳動によって実行できます。

歴史

1930年代–ゲル電気泳動にショ糖を使用した最初の報告
1955 –澱粉ゲルの導入、平凡な分離（Smithies）
1959 –アクリルアミドゲルの導入。ディスク電気泳動（OrnsteinおよびDavis）;細孔径や安定性などのパラメーターの正確な制御。および（Raymond and Weintraub）
1966 –寒天ゲルの最初の使用
1969 –変性剤の導入、特にタンパク質サブユニットのSDS分離（WeberおよびOsborn）
1970 – LaemmliはスタッキングゲルとSDSを使用してT4ファージの28の成分を分離しました
1972 –臭化エチジウム染色によるアガロースゲル
1975 – 2次元ゲル（O'Farrell）;等電点電気泳動、SDSゲル電気泳動
1977 –ゲルの配列決定
1983 –パルスフィールドゲル電気泳動により、大きなDNA分子の分離が可能に
1983 –キャピラリー電気泳動の導入
2004 –アクリルアミドゲルの標準化された重合時間の導入により、天然タンパク質のクリーンで予測可能な分離が可能になりました（Kastenholz）

Milan Bierによる1959年の電気泳動に関する本は、1800年代の参考文献を引用しています。しかし、オリバー・スミシーズは大きな貢献をしました。 Bier氏は次のように述べています。「Smidiesの手法は、その独自の分離力により幅広い用途を見出しています。」コンテキストで考えると、Bierは、Smithiesの方法が改善されていることを明確に暗示しています。