蛍光異方性
蛍光異方性または蛍光偏光は、発蛍光団が発する光が異なる偏光軸に沿って異なる強度を持つ現象です。この分野の初期の先駆者には、アレクサンダーヤブロンスキー、グレゴリオウェーバー、アンドレアスアルブレヒトが含まれます。蛍光偏光の原理とメソッドのいくつかのアプリケーションは、Lakowiczの本に記載されています。
蛍光異方性の定義
光源の異方性（r）は、偏光成分と全強度の比（IT {\ displaystyle I_ {T}}）として定義されます。
r = Iz−IyIx + Iy + Iz {\ displaystyle r = {\ frac {I_ {z} -I_ {y}} {I_ {x} + I_ {y} + I_ {z}}}}
励起がz軸に沿って偏光している場合、フルオロフォアからの発光はz軸を中心に対称です（図）。したがって、統計的にはIx = Iy {\ displaystyle I_ {x} = I_ {y}}になります。 Iy =I⊥{\ displaystyle I_ {y} = I _ {\ perp}}、およびIz =I∥{\ displaystyle I_ {z} = I _ {\ parallel}}であるため、
r =I∥-I⊥I∥+2I⊥=I∥-I⊥IT{\ displaystyle r = {\ frac {I _ {\ parallel} -I _ {\ perp}} {I _ {\ parallel} + 2I _ {\ perp}}} = {\ frac {I _ {\ parallel} -I _ {\ perp}} {I_ {T}}}}。
原理-ブラウン運動と写真選択
蛍光では、分子は光子を吸収し、より高いエネルギー状態に励起されます。短い遅延（蛍光寿命τ{\ displaystyle \ tau}で表される平均）の後、エネルギーの一部を熱として失い、残りのエネルギーを別の光子として放出することにより、より低い状態になります。励起と脱励起は、分子の周りの電子の再分布を伴います。したがって、光子による励起は、光の電界が分子の周りの特定の軸に向けられている場合にのみ発生します。また、放出された光子は、分子に対して特定の偏光を持ちます。
異方性測定のために理解する最初の概念は、ブラウン運動の概念です。目に見えるガラスに含まれる室温の水は非常に静かに見えるかもしれませんが、分子レベルでは各水分子は運動エネルギーを持っているため、水分子同士の衝突が連続して発生します。溶液中に懸濁したナノ粒子（図の黄色の点）は、これらの基礎となる衝突の合計によりランダムウォークを受けます。分子が1ラジアン回転するのにかかる時間である回転相関時間（ Φr ）は、ナノ粒子の粘度（ η ）、温度（T）、ボルツマン定数（ kB ）および体積（ V ）に依存します。
ϕr =ηVkBT{\ displaystyle \ phi _ {r} = {{\ eta V} \ over {k {_ {B}} T}}}
2番目の概念は、偏光の使用による光選択です。ランダムに配向された蛍光団のグループに偏光が適用されると、励起された分子のほとんどは、適用された偏光に対して特定の角度範囲内に配向された分子になります。それらが動かない場合、放出された光は、適用された光に対して特定の角度範囲内で偏光されます。
単一光子励起の場合、固有異方性r 0の最大理論値は、励起および放出双極子が平行のとき0.4であり、励起および放出双極子が垂直のとき最小値-0.2です。
r0 = 25（3cos2β-12）{\ displaystyle {r_ {0}} = {2 \ over 5} \ left（{{3 {{\ cos} ^ {2}} \ beta -1} \ over 2} \右）}
ここで、βは励起双極子と放射双極子の間の角度です。定常状態の蛍光測定では、通常、凍結されたポリオールにフルオロフォアを埋め込むことで測定されます。
理想的な最も単純なケースを取り上げると、単一指数蛍光寿命τ{\ displaystyle \ tau}およびr0 = 0.4（〜0.05の吸光度を有するエチレングリコール中のローダミン6gが溶液中に懸濁した色素分子のサブセットが良いテストですサンプル）。励起が無偏光の場合、測定された蛍光発光も同様に無偏光でなければなりません。ただし、励起偏光子を使用して励起光源を垂直に偏光すると、測定された蛍光に偏光効果が現れます。これらの偏光アーティファクトは、54.7ºのマジックアングルに放射偏光子を配置することで対処できます。放射偏光子が垂直偏光の場合、ブラウン運動により色素分子が初期の垂直偏光構成から非偏光構成に移動するため、蛍光がさらに失われます。一方、放射偏光子が水平方向に偏光している場合、最初は垂直方向に偏光し、ブラウン運動により偏光解消した励起分子がさらに導入されます。蛍光の合計と差は、それぞれ強度の加算と蛍光強度の減算によって構成できます。
S = IVV + 2GIVH {\ displaystyle S = {I_ {VV}} + 2G {I_ {VH}}}
D = IVV−GIVH {\ displaystyle D = {I_ {VV}}-G {I_ {VH}}}
差を合計で割ると、異方性減衰が得られます。
r = DS {\ displaystyle r = {D \ over S}}
グレーティングファクターGは、垂直方向に対する水平方向の放射光学系の機器の優先度です。励起偏光子を水平方向に動かし、放射偏光子がそれぞれ垂直偏光と水平偏光の場合の強度を比較することで測定できます。
G = IHHIHV {\ displaystyle G = {{I_ {HH}} \ over {I_ {HV}}}}
Gは発光波長に依存します。文献のGは、示されている逆数として定義されています。
入射光と放出光の偏光の非相関の程度は、蛍光寿命（τ{\ displaystyle \ tau}）と比較して、発蛍光団の向きがスクランブルされる速度（回転寿命ϕ {\ displaystyle \ phi}）に依存します。方向のスクランブルは、分子全体のタンブリングによって、または蛍光部分のみの回転によって発生する可能性があります。タンブリングの速度は、ペリン方程式によって測定された異方性に関連しています。
r（τ）= r01 +τ/ ϕ {\ displaystyle r（\ tau）= {\ frac {r_ {0}} {1+ \ tau / \ phi}}}
ここで、rは観測された異方性、r0は分子の固有の異方性、τ{\ displaystyle \ tau}は蛍光寿命、ϕ {\ displaystyle \ phi}は回転時定数です。
この分析は、フルオロフォアが比較的離れている場合にのみ有効です。それらが非常に近接している場合、FRETによってエネルギーを交換できます。また、放出は多くの独立して移動する（または配向した）分子の1つから発生する可能性があるため、異方性が予想より低いか、またはより大きな相関関係がなくなりますこのタイプのホモトランスファー共鳴エネルギー移動は、エネルギー移動FRETまたはemFRETと呼ばれます。
定常状態の蛍光異方性は、「平均」異方性のみを示します。異方性減衰のフィッティングから減衰時間、残留異方性、および回転相関時間をすべて決定できる時間分解蛍光異方性を使用すると、さらに多くの情報を取得できます。通常、励起には垂直パルスレーザー光源が使用され、レーザーの開始パルス（開始）と蛍光光子の測定（停止）の間にタイミング電子回路が追加されます。通常、時間相関単一光子計数（TCSPC）技術が採用されています。
ここでも理想的な最も単純なケースを使用して、単一指数の蛍光寿命τ{\ displaystyle \ tau}および初期異方性r0 = 0.4を有する色素分子のサブセットを溶液に懸濁しました。サンプルがパルス化された垂直方向の励起源で励起される場合、放射偏光子がマジック角にあるときに単一の減衰時間τ{\ displaystyle \ tau}を測定する必要があります。放射偏光子が垂直偏光の場合、正の前指数因子で2つの減衰時間を測定する場合、最初の減衰時間は、無偏光の発光セットアップと2番目の減衰時間で測定したτ{\ displaystyle \ tau}と等しくなければなりません。これは、ブラウン運動により色素分子が初期の垂直偏光構成から非偏光構成に移動するため、蛍光が失われるためです。一方、放射偏光子が水平偏光している場合、2つの減衰時間は再び正の前指数因子を持つ最初の減衰時間に回復し、τ{\ displaystyle \ tau}と同等になりますが、2番目の減衰時間は負になります最初に垂直に分極され、ブラウン運動によって脱分極された励起分子の導入に起因する前指数因子。蛍光の和と差は、それぞれ減衰の加算と蛍光減衰の減算によって構成できます。
S（t）= GIVV（t）+ 2IVH（t）{\ displaystyle S（t）= G {I_ {VV}}（t）+2 {I_ {VH}}（t）}
D（t）= GIVV（t）−IVH（t）{\ displaystyle D（t）= G {I_ {VV}}（t）-{I_ {VH}}（t）}
差を合計で割ると、異方性減衰が得られます。
r（t）= D（t）S（t）{\ displaystyle r（t）= {D（t）\ over S（t）}}
1種類の球状染料のみの最も単純な場合：
r（t）=r0exp（−tϕr）{\ displaystyle r（t）= {r_ {0}} \ exp \ left（{-{t \ over {\ phi _ {r}}}} \ right）}
用途
蛍光異方性を使用して、分子の回転時間の変化を引き起こす反応の結合定数と反応速度を測定できます。フルオロフォアが小分子の場合、大きなタンパク質に結合すると、タンブルの速度は大幅に低下します。フルオロフォアが結合ペアの大きなタンパク質に結合している場合、結合状態と非結合状態の偏光の差は小さくなり（非結合タンパク質はすでにかなり安定しており、最初はゆっくり回転するため）、測定の精度が低下します。結合の程度は、2つの結合パートナーを滴定することで測定される、部分的に結合した状態、遊離状態、完全に結合した状態（タンパク質の大過剰）の異方性の違いを使用して計算されます。
フルオロフォアがタンパク質やRNAなどの比較的大きな分子に結合している場合、フォールディングに伴う移動度の変化を使用して、フォールディングのダイナミクスを調べることができます。これにより、タンパク質が最終的な安定した3D形状を実現する方法のダイナミクスの尺度が提供されます。
蛍光異方性は顕微鏡にも適用され、照明光の経路でカメラの前に偏光子を使用します。これは、サイトゾルまたは膜の局所粘度を研究するために使用でき、後者は膜の微細構造とさまざまな脂質の相対濃度に関する情報を提供します。この手法は、特定のキューに応じて、シグナル伝達カスケードでのパートナーへの分子の結合を検出するためにも使用されています。
emFRETの現象と、フルオロフォア間で密接な相互作用が発生した場合の異方性の関連する減少を使用して、シグナル伝達に応答するタンパク質の凝集を研究しています。
