シリンドロスペルモプシン
シリン ドロスペルモプシン （ CYNまたはCYLと略される）は、さまざまな淡水シアノバクテリアによって生成されるシアノトキシンです。 CYNは、グアニジノおよび硫酸基を含む多環式ウラシル誘導体です。また、両性イオンであるため、水溶性が高くなります。 CYNは肝臓および腎臓組織に対して毒性があり、タンパク質合成を阻害し、DNAおよび/またはRNAを共有結合的に修飾すると考えられています。シリンドロスペルモプシンが発がん性物質であるかどうかは不明ですが、マウスでは腫瘍を開始する活性はないようです。
CYNは、オーストラリアのクイーンズランド州のパーム島で謎の病気が発生した後に初めて発見されました。アウトブレイクは、地元の飲料水供給地でのCylindrospermopsis raciborskiiの開花までさかのぼり、その後、毒素が特定されました。毒素の分析により、1992年に提案された化学構造が導き出され、2000年に合成が達成された後に改訂されました。毒性および非毒性のCYNのいくつかの類似体が単離または合成されました。
C. raciborskiiは主に熱帯地域で観察されていますが、最近ではオーストラリア、北アメリカ、南アメリカ、ニュージーランド、ヨーロッパの温帯地域でも発見されています。しかし、C。raciborskiiのCYN生産株はヨーロッパでは特定されておらず、大陸中に存在する他のいくつかのシアノバクテリア種がそれを合成することができます。
発見
1979年、オーストラリアのクイーンズランド州パーム島の住民138人が入院し、胃腸炎のさまざまな症状に苦しんでいました。これらはすべて子供でした。さらに、10人の成人が影響を受けましたが、入院していませんでした。腹痛や嘔吐などの初期症状は、肝炎の症状に似ていました。その後の症状には、腎不全や血性下痢が含まれます。尿分析では、多くの患者で高レベルのタンパク質、ケトン、糖が、血液やウロビリノーゲンが少ない数値で明らかになりました。糞便の顕微鏡検査と毒物スクリーニングと一緒の尿分析は、症状への統計的リンクを提供できませんでした。すべての患者は4〜26日以内に回復し、その時点でアウトブレイクの明らかな原因はありませんでした。原因に関する当初の考えには、水質の悪さと食事が含まれていましたが、決定的なものはなく、この病気は「パームアイランドミステリー病」と名付けられました。
当時、この発生は地元の飲料水供給における深刻な藻類のブルームと一致しており、問題のダムに焦点を合わせた直後に気づいた。この「謎の病気」の疫学研究は、病気になった人がダムの水を使っていたため、後にソロモンダムが関係していることを確認しました。硫酸銅による藻類ブルームの最近の処理が藻類細胞の溶解を引き起こし、水に毒素を放出することが明らかになりました。オーストラリアの海域で、以前に未知の属アナベナの2、およびCylindrospermopsisのraciborskii、：ダムの研究は、藻類の定期的な花を咲かせるが、3つのシアノバクテリアの株によって主に引き起こされたことを明らかにしました。 3つのマウスバイオアッセイは、2つのアナベナ株が無毒であるにもかかわらず、 C。ラシボルスキーが非常に有毒であることを示しました。その後、原因となった化合物が分離され、毒素シリンドロスペルモプシンが同定されました。
後の報告では、代わりに、水中の過剰な銅が病気の原因であると提案しました。過剰な投与は、藻類を制御するための最小コストの請負業者の使用に続いており、この分野では資格がありませんでした。
化学
構造決定
オリジナルのPalm Island株から培養されたシアノバクテリアを使用した毒素の分離は、水性抽出物のゲルろ過とそれに続く逆相HPLCによって達成されました。構造解析は、質量分析（MS）および核磁気共鳴（NMR）実験により達成され、構造（後にわずかに不正確であることが証明されました）が提案されました（図1）。
このほぼ正しい分子は、三環式グアニジン基（環A、BおよびC）とウラシル環（D）を持っています。分子内の荷電領域の存在が極性溶媒に適した双極子効果を生み出すため、分子の双性イオン性により、この水溶性が高くなります。 NMRスペクトルの重要なシグナルのpHのわずかな変化に対する感度は、ウラシル環がケト/エノール互変異性の関係にあり、水素移動により2つの異なる構造が生じることを示唆しています（図2）。元々、エノール互変異性体のウラシルとグアニジン基の間の水素結合がこれを支配的な形態にすることが提案されていました。
アナログ
C. raciborskiiの 2番目の代謝物は、UVおよびMS実験中にCYNのピークに付随して頻繁に発生するピークを観察した後、シアノバクテリアの抽出物から同定されました。 MSおよびNMR法による分析により、この新しい化合物はウラシル環に隣接する酸素を欠いており、デオキシシリンドロスペルモプシンと命名されたと結論付けられました（図3）。
1999年には、7-エピサイクリンドロスペルモプシン（epiCYN）というCYNのエピマーも、 Aphanizomenon ovalisporumからの微量代謝物として同定されました。これは、イスラエルのキネレット湖から採取したシアノバクテリアからCYNを分離する際に発生しました。この分子の提案された構造は、ウラシル環に隣接するヒドロキシル基の配向のみがCYNと異なっていました（図4）。
全合成
CYNへの合成アプローチは、ピペリジン環（A）から始まり、環BとCの環化に進みました。CYNの最初の全合成は、2000年に20段階のプロセスで報告されました。
epiCYNの6つの立体中心のそれぞれを制御する合成プロセスにより、CYNとepiCYNの両方の元の割り当てが実際には正しい構造の反転であることが確立されました。 WhiteとHansenによる代替アプローチは、これらの絶対構成をサポートしていました（図5）。この正しい割り当ての時点で、エノール型が支配的ではないことが示唆されました。
安定
CYNの毒性に関連する重要な要因の1つは、その安定性です。毒素は、日光にさらされると藻類の抽出物で急速に分解することがわかっていますが、pHと温度の変化による分解に耐性があり、純粋な固体または純水のいずれでも分解を示しません。その結果、濁った不動の水では、毒素は長期間持続する可能性があり、熱湯はシアノバクテリアを殺しますが、毒素を除去できない可能性があります。
毒性学
毒性効果
ホーキンス等。 。元のパームアイランド株の抽出物を使用したマウスバイオアッセイによるCYNの毒性効果を実証しました。急性中毒マウスは、食欲不振、下痢、あえぎ呼吸を示した。剖検の結果、肺、肝臓、腎臓、小腸、副腎の出血が明らかになりました。病理組織検査により、肝臓および肺の血管における肝細胞の用量関連壊死、脂質蓄積、およびフィブリン血栓形成、ならびに腎臓の領域におけるさまざまな上皮細胞壊死が明らかになりました。
シリンドロスペルモプシンの影響のより最近のマウスバイオアッセイは、致死量と非致死量の両方で肝臓重量の増加を明らかにしました。さらに、肝臓は暗色に見えた。致死量を投与したマウスでは肝細胞の広範な壊死が見られ、非致死量を投与したマウスでも局所的な損傷が観察されました。
毒性
1985年のCYNの毒性の初期推定値は、24時間でのLD50が腹腔内注射で凍結乾燥培養物64±5 mg /マウス体重1 kgであったことでした。 1997年のさらなる実験では、24時間で52 mg / kg、7日で32 mg / kgのLD50が測定されましたが、使用した超音波処理細胞の分離株に別の毒性化合物が存在することがデータから示唆されました大谷らによる予測24時間の毒性についてはかなり高く、測定された比較的低い24時間の毒性レベルを説明するために別の代謝物が存在することが提案されました。
人間がCYNを摂取する可能性が最も高いのは摂取であるため、マウスで経口毒性実験を実施しました。経口LD50は4.4-6.9 mg CYN / kgであり、食道胃粘膜の潰瘍形成に加えて、症状は腹腔内投与のそれと一致していた。胃の内容物には培養物が含まれていたため、これらのLD50値は過大評価されている可能性があります。
作用機序
CYN中毒に関連する病理学的変化は、タンパク質合成の阻害、膜の増殖、細胞内の脂質蓄積、最後に細胞死の4つの異なる段階にあると報告されました。剖検で摘出されたマウス肝臓の検査により、CYNの腹腔内注射で、粗面小胞体（rER）からのリボソームが16時間後に剥離し、24時間で、平滑ERおよびゴルジ装置の膜系の著しい増殖が発生したことが示されました。 48時間で、小さな脂肪滴が細胞体に蓄積し、100時間で、肝小葉の肝細胞は機能を超えて破壊されました。
タンパク質合成阻害のプロセスは不可逆的であることが示されていますが、最終的に化合物の細胞毒性の方法ではありません。 Froscio et al。 。 CYNには少なくとも2つの別々の作用モードがあると提案されています：以前に報告されたタンパク質合成阻害と、細胞死を引き起こすまだ不明な方法です。細胞は、タンパク質合成の90％阻害で長期間（最大20時間）生存し、生存率を維持できることが示されています。 CYNは16〜18時間以内に細胞毒性を示すため、他のメカニズムが細胞死の原因であることが示唆されています。
P450の作用をブロックするとCYNの毒性が低下するため、シトクロムP450はCYNの毒性に関与しています。 CYNの活性化されたP450由来代謝産物（または代謝産物）が毒性の主な原因であることが提案されています。ショー等。 。毒素はin vivoで代謝され、肝臓組織に代謝物が結合し、ラットの肝細胞では他の細胞型よりも損傷が多いことが示されました。
硫酸基、グアニジン基、ウラシル基を含むCYNの構造により、CYNはDNAまたはRNAに作用することが示唆されています。ショー等。 。報告されたCYNまたはその代謝物のマウスにおけるDNAへの共有結合、およびDNA鎖切断も観察されました。 Humpage et al。また、これを支持し、さらに、CYN（または代謝物）が細胞分裂中に紡錘体または動原体のいずれかに作用し、染色体全体の損失を引き起こすと仮定しました。
CYNのウラシル基は、毒素のファーマコフォアとして同定されています。 2つの実験では、ウラシル環のビニル水素原子が塩素原子に置き換わって5-クロロシリンドロスペルモプシンを形成し、ウラシル基はカルボン酸に切断されて、シリンドロスペルミン酸を形成しました（図6）。どちらの製品も、CYNのLD50の50倍であっても非毒性であると評価されました。デオキシシリンドロスペルモプシンの構造の以前の決定において、化合物の毒性評価が実施された。 CYNの5日間中央値致死量の4倍を腹腔内注射したマウスには毒性作用は見られませんでした。この化合物は比較的豊富であることが示されたため、この類似体は比較的無毒であると結論付けられました。 CYNとepiCYNの両方が毒性であるとすると、ウラシルブリッジのヒドロキシル基は毒性に必要であると考えることができます。まだ、CYNとepiCYNの相対的な毒性は比較されていません。
関連する毒性ブルームとその影響
パームアイランドの発生以来、CYNを生成するシアノバクテリアの他のいくつかの種が確認されています： Anabaena bergii 、 Anabaena lapponica 、 Aphanizomenon ovalisporum 、 Umezakia natans 、 Raphidiopsis curvata 。およびAphanizomenon issatschenkoi 。オーストラリアには、 アナベナサーキュナリス 、 ミクロシスティス種、 C。ラシボルスキーという 3つの主要な有毒シアノバクテリアが存在します。これらのうち、CYNを生成する後者は、パームアイランドの発生だけでなく、種がより温帯な地域に広がっているため、かなりの注目を集めています。以前、藻類は熱帯のみに分類されていましたが、最近ではオーストラリア、ヨーロッパ、南北アメリカ、ニュージーランドの温帯地域で発見されています。
1997年8月、クイーンズランド州北西部の農場で、シリンドロスペルモプシン中毒により3頭の牛と10頭の子牛が死亡しました。藻類ブルームを含む近くのダムがテストされ、 C。raciborskiiが特定されました。 HPLC /質量分析による分析により、バイオマスのサンプルにCYNが存在することが明らかになりました。子牛の1人の剖検で、心臓と小腸の出血とともに、肝臓と胆嚢の腫れが報告されました。肝組織の組織学的検査は、CYNに感染したマウスで報告されたものと一致していました。これは、オーストラリアで動物の死亡を引き起こしたC. raciborskiiの最初の報告でした。
オーストラリアのタウンズビルにある養殖池でのC. raciborskiiの開花の影響は、1997年に評価されました。分析により、水には細胞外と細胞内の両方のCYNが含まれており、ザリガニは主に肝臓だけでなく筋肉組織にも蓄積していることが明らかになりました。腸の内容を調べると、シアノバクテリア細胞が明らかになり、ザリガニが細胞内毒素を摂取したことが示されました。ブルームの抽出物を使用した実験は、細胞外毒素を組織に直接取り込むことも可能であることを示しました。特に水産養殖業におけるそのような生物蓄積は、特に人間が製品のエンドユーザーである場合に懸念されていました。
シアノバクテリアのブルームの影響は経済的に評価されています。 1991年12月、世界最大の藻類の開花がオーストラリアで発生し、ダーリングバーウォン川の1000 kmが影響を受けました。 100万人日分の飲料水が失われ、発生した直接費用は合計で130万豪ドルを超えました。さらに、2000日間のレクリエーションも失われ、観光、宿泊、輸送などの間接的に影響を受ける産業を考慮した後、経済的コストは1,000万豪ドルと見積もられました。
水サンプルの現在の分析方法
現在の方法には、質量分析（LC-MS）に結合した液体クロマトグラフィー、マウスバイオアッセイ、タンパク質合成阻害アッセイ、逆相HPLC-PDA（フォトダイオードアレイ）分析が含まれます。 HPLC-MSに匹敵すると思われる無細胞タンパク質合成アッセイが開発されました。
