アンチトロンビン

アンチトロンビン （AT）は、凝固系のいくつかの酵素を不活性化する小さなタンパク質分子です。アンチトロンビンは、肝臓で産生される糖タンパク質であり、432個のアミノ酸で構成されています。 3つのジスルフィド結合と合計4つの可能なグリコシル化部位が含まれています。 α-アンチトロンビンは、血漿中に見られるアンチトロンビンの主要な形態であり、4つのグリコシル化部位のそれぞれを占めるオリゴ糖を持っています。アンチトロンビン、β-アンチトロンビンのマイナー型では、単一のグリコシル化部位が一貫して占有されないままです。その活性は、抗凝固薬ヘパリンによって何倍にも増加します。ヘパリンは、アンチトロンビンの因子IIa（トロンビン）および因子Xaへの結合を促進します。

命名法

アンチトロンビンは、 アンチトロンビンIII （AT III）とも呼ばれます。アンチトロンビンIからアンチトロンビンIVまでの名称は、1950年代にSeegers、Johnson、およびFellによって行われた初期の研究に由来しています。

アンチトロンビンI（AT I）は、トロンビンがフィブリノーゲンを活性化した後のトロンビンのフィブリンへの吸収を指します。アンチトロンビンII（AT II）は、ヘパリンとともにトロンビンとフィブリノーゲンの相互作用を妨げる血漿中の補因子を指します。アンチトロンビンIII（AT III）は、トロンビンを不活性化する血漿中の物質を指します。アンチトロンビンIV（AT IV）は、血液凝固中および血液凝固直後に活性化されるアンチトロンビンを指します。医学的に重要なのはAT IIIとおそらくAT Iだけです。 AT IIIは一般に「アンチトロンビン」と呼ばれ、この記事で説明されているのはアンチトロンビンIIIです。

構造

アンチトロンビンの血漿中半減期は約3日間です。ヒト血漿中の正常なアンチトロンビン濃度は約0.12 mg / mlと高く、これは2.3μMのモル濃度に相当します。アンチトロンビンは、人間に加えて多くの種の血漿から分離されています。タンパク質およびcDNAシーケンスから推測されるように、ウシ、ヒツジ、ウサギ、およびマウスのアンチトロンビンはすべて433アミノ酸の長さであり、ヒトアンチトロンビンよりも1アミノ酸長いです。余分なアミノ酸は、アミノ酸位置6で発生すると考えられています。牛、羊、ウサギ、マウス、およびヒトのアンチトロンビンは、84〜89％のアミノ酸配列同一性を共有しています。 6つのアミノ酸が3つの分子内ジスルフィド結合、Cys8-Cys128、Cys21-Cys95、およびCys248-Cys430を形成します。それらはすべて4つの潜在的なN-グリコシル化部位を持っています。これらは、ヒトではアスパラギン（Asn）のアミノ酸番号96、135、155、および192で、他の種では同様のアミノ酸番号で発生します。これらのすべての部位は、ヒトアンチトロンビン、α-アンチトロンビンの優勢な形で共有結合したオリゴ糖側鎖で占められており、この形のアンチトロンビンの分子量は58,200になります。アスパラギン135の潜在的なグリコシル化部位は、アンチトロンビン、β-アンチトロンビンのマイナー型（約10％）で占有されていません（ 図1を参照）。

バキュロウイルスに感染した昆虫細胞および細胞培養で増殖した哺乳類細胞株を使用して、通常のヒトアンチトロンビンと類似の特性を持つ組換えアンチトロンビンが生産されています。これらの組換えアンチトロンビンは、通常、通常のアンチトロンビンとは異なるグリコシル化パターンを持ち、一般にアンチトロンビン構造研究で使用されます。このため、タンパク質データバンクに保存され、この記事で紹介したアンチトロンビン構造の多くは、さまざまなグリコシル化パターンを示しています。

アンチトロンビンは、潜在状態に比べて自由エネルギーが高いネイティブ状態で始まり、3日後に平均まで減衰します。潜在状態は、活性化状態と同じ形、つまりトロンビンを阻害している状態です。このように、それは、タンパク質の折りたたみの速度論的対熱力学的制御の有用性の古典的な例です。

関数

アンチトロンビンはセルピン（セリンプロテアーゼ阻害剤）であるため、アルファ1アンチキモトリプシン、アルファ2アンチプラスミン、ヘパリン補因子IIなど、他のほとんどの血漿プロテアーゼ阻害剤と構造が類似しています。

アンチトロンビンの生理学的標的プロテアーゼは、 接触活性化経路 （以前は内因性経路として知られていました）のプロテアーゼ、すなわち因子X（Xa）、因子IX（IXa）、因子XI（XIa）、因子XII（XIIa）の活性化されたものですさらに、より大きな範囲で、因子II（トロンビン）（IIa）、および組織因子経路 （以前は外因性経路として知られていた）からの活性化された因子VII（VIIa）も含まれます。この阻害剤は、血液凝固にも関与するカリクレインとプラスミンも不活性化します。しかし、トリプシンや古典的な補体経路に関与する酵素C1のC1sサブユニットなど、凝固に関与しない特定の他のセリンプロテアーゼを不活性化します。

プロテアーゼの不活性化は、プロテアーゼ酵素の活性部位がその通常の基質に到達できないアンチトロンビンと等モルの複合体にプロテアーゼを閉じ込めた結果として生じる。アンチトロンビン-プロテアーゼ複合体の形成には、プロテアーゼとアンチトロンビン内の特定の反応性ペプチド結合との相互作用が含まれます。ヒトアンチトロンビンでは、この結合はアルギニン（arg）393とセリン（ser）394の間にあります（ 図2と図3を参照）。

プロテアーゼ酵素は、反応性結合への攻撃の結果として、不活性なアンチトロンビン-プロテアーゼ複合体に閉じ込められると考えられています。通常のプロテアーゼ基質内の同様の結合を攻撃すると、基質のタンパク質分解が急速に切断されますが、アンチトロンビン反応性結合への攻撃を開始すると、アンチトロンビンが活性化され、タンパク質分解プロセスの中間段階で酵素がトラップされます。時間が経つと、トロンビンはアンチトロンビン内の反応性結合を切断することができ、不活性なアンチトロンビン-トロンビン複合体は解離しますが、これが発生するのにかかる時間は3日以上かかる場合があります。しかし、結合P3-P4およびP1'-P2 'は、それぞれ好中球エラスターゼおよび細菌の酵素サーモリシンによって迅速に切断され、トロンビン活性を阻害できなくなった不活性なアンチトロンビンをもたらします。

好中球エラスターゼによる不活性化と同様に、アンチトロンビンによるプロテアーゼ活性の阻害率は、ヘパリンへの追加の結合により大幅に強化されます。

アンチトロンビンとヘパリン

アンチトロンビンは、生理的標的酵素であるトロンビン、第Xa因子、第IXa因子をそれぞれ7〜11 x 103、2.5 x 103 M-1 s-1、1 x 10 M-1 s-1の速度定数で不活性化します。ヘパリンの存在下では、アンチトロンビン-トロンビン不活性化の速度は1.5-4 x 107 M-1 s-1に増加します。つまり、反応は2000-4000倍加速されます。第Xa因子阻害は、ヘパリンの存在下で500〜1000倍だけ加速され、最大速度定数はトロンビン阻害の速度定数より10倍低くなります。アンチトロンビン因子IXa阻害の速度増強は、ヘパリンおよびカルシウムの生理学的レベルの存在下で約100万倍の増強を示します。

AT-IIIは、ヘパリンポリマー内に含まれる特定の五糖硫酸化配列に結合します。

GlcNAc / NS（6S）-GlcA-GlcNS（3S、6S）-IdoA（2S）-GlcNS（6S）

この五糖配列に結合すると、2つの異なるメカニズムの結果として、ヘパリンによってプロテアーゼ活性の阻害が増加します。 1つのメカニズムでは、因子IXaおよびXa阻害のヘパリン刺激は、反応部位ループを含むアンチトロンビン内の立体構造変化に依存し、したがってアロステリックです。別のメカニズムでは、トロンビン阻害の刺激は、AT-III、トロンビン、およびヘパリン間の三元複合体の形成に依存します。

アロステリック活性化

因子IXaおよびXa阻害の増加には、最小限のヘパリン五糖配列が必要です。五糖結合に応答してアンチトロンビン内で発生する立体構造の変化は十分に文書化されています。

ヘパリンが存在しない場合、反応部位ループのアミノ酸P14およびP15（ 図3を参照）はタンパク質の本体（具体的にはベータシートAの上部）に埋め込まれます。この機能は、ヘパリン補因子II、アルファ1アンチキモトリプシン、MENTなどの他のセルピンと共通しています。

因子IXaおよびXaの阻害に最も関連する立体構造の変化には、反応部位ループのN末端領域内のP14およびP15アミノ酸が含まれます（ 図4モデルBの丸で囲んだ部分）。この領域は、ヒンジ領域と呼ばれています。ヘパリン結合に応答したヒンジ領域内の立体構造変化は、タンパク質の本体からのP14およびP15の排除をもたらし、この立体構造変化を防ぐことにより、因子IXaおよびXa阻害の増加が起こらないことが示されています。ヒンジ領域の立体構造変化の結果として反応部位ループに与えられる柔軟性の増加は、因子IXaおよびXa阻害の増加に影響を与える重要な要因であると考えられています。五糖の非存在下では、400個のアンチトロンビン分子のうちの1個（0.25％）のみが、放出されたP14およびP15アミノ酸との活性な立体配座にあると計算されています。

非アロステリック活性化

トロンビン阻害の増加には、最小限のヘパリン五糖に加えて、少なくとも追加の13モノマー単位が必要です。これは、アンチトロンビンとトロンビンが互いに隣接する同じヘパリン鎖に結合しなければならないという要件によると考えられています。これは、 図5に示す一連のモデルで見ることができます。

図5に示す構造では、反応部位ループのC末端部分（P '側）は、他の非活性化またはヘパリン活性化アンチトロンビン構造と比較した場合、コンフォメーションが長くなっています。アンチトロンビンのP '領域は、他のセルピンのP'領域に比べて異常に長く、非活性化またはヘパリン活性化アンチトロンビン構造では、しっかりと水素結合したβターンを形成します。 P '伸長は、βターンに関与するすべての水素結合の切断により発生します。

図5複合体のアンチトロンビンのヒンジ領域は、その立体構造の柔軟性のためにモデル化できず、アミノ酸P9-P14はこの構造には見られません。この立体構造の柔軟性は、P14 P15反応部位ループ挿入アンチトロンビン立体構造とP14 P15反応部位ループ排出立体構造との複合体内に平衡が存在する可能性があることを示しています。これをサポートするために、図5の複合体（モデルBでラベル付け）でのP15 Glyの位置の分析により、ベータシートAに挿入されることが示されています（モデルCを参照）。

活性に対するグリコシル化の影響

α-アンチトロンビンとβ-アンチトロンビンは、ヘパリンに対する親和性が異なります。 2つの間の解離定数の差は、 図3に示す五糖では3倍、全長ヘパリンでは10倍を超え、β-アンチトロンビンの親和性は高くなります。 β-アンチトロンビンの親和性が高いのは、最初のヘパリン結合時にタンパク質内で後続のコンフォメーション変化が起こる速度の増加によると考えられています。 α-アンチトロンビンの場合、Asn-135での追加のグリコシル化は、初期ヘパリン結合を妨害するのではなく、結果として生じるコンフォメーション変化を阻害すると考えられています。

ヘパリン親和性が増加するため、α-アンチトロンビンのレベルがわずか5〜10％であるにもかかわらず、組織損傷に起因する血栓形成イベントの制御において、β-アンチトロンビンはα-アンチトロンビンよりも重要であると考えられます。実際、大動脈の損傷後のトロンビン阻害は、β-アンチトロンビンのみに起因しています。

疾患における役割

アンチトロンビンが正常な血液凝固の調節に果たす重要な役割の証拠は、遺伝性または後天性のアンチトロンビン欠乏症と、罹患者が血栓性疾患を発症するリスクの増加との相関関係によって示されます。塞栓症。

後天性アンチトロンビン欠乏症

後天的なアンチトロンビン欠乏症は、3つの明らかに異なるメカニズムの結果として発生します。最初のメカニズムは、タンパク尿ネフローゼ症候群に関連する腎不全で発生する排泄の増加です。 2番目のメカニズムは、肝不全や肝硬変、または早産に続発する未熟な肝臓で見られる生産の減少に起因します。第三のメカニズムは、重傷による外傷の結果として最も顕著であるが、大手術や心肺バイパスなどの介入の結果としてより小さな規模で見られる可能性のある消費の加速に起因します。

遺伝性アンチトロンビン欠乏症

遺伝性アンチトロンビン欠乏症の発生率は正常な集団で1：2000から1：5000と推定されており、遺伝性アンチトロンビン欠乏症に苦しむ最初の家族は1965年に記載されています。その後、遺伝性アンチトロンビン欠乏症の分類は機能的および免疫化学的アンチトロンビン分析に基づいて、タイプIまたはタイプIIのいずれかに指定されています。血液凝固プロテアーゼの効果的な阻害を確実にするためには、正常な機能レベルの少なくとも70％である適切なレベルのアンチトロンビン活性の維持が不可欠です。通常、I型またはII型のアンチトロンビン欠乏の結果として、機能的アンチトロンビンレベルは正常の50％未満に低下します。

I型アンチトロンビン欠乏症は、罹患者の血中のアンチトロンビン活性とアンチトロンビン濃度の両方の減少を特徴としています。 I型欠損症はもともと、ヘパリン親和性に基づいて、IaとIbの2つのサブグループにさらに分けられました。サブグループIaの個人のアンチトロンビンは、ヘパリンに対して通常の親和性を示したが、サブグループIbの個人のアンチトロンビンは、ヘパリンに対して減少した親和性を示した。 1b症例のグループのその後の機能分析により、ヘパリン親和性が低下するだけでなく、反応部位、ヘパリン結合部位、およびアンチトロンビン血中濃度に影響を及ぼす複数のまたは「多面的な」異常が見られました。血栓症および止血に関する国際学会の科学および標準化委員会によって採用された改訂された分類システムでは、Ib型の症例は現在、II型PE、Pleiotrophic effectとして指定されています。

I型欠乏症のほとんどの症例は、アンチトロンビン遺伝子内の点突然変異、欠失、または軽微な挿入によるものです。これらの遺伝子変異は、さまざまなメカニズムを介してI型欠乏症を引き起こします。

• 突然変異は不安定なアンチトロンビンを生成する可能性があり、生合成の完了時に血液中に正しく輸出されないか、または短期間に血液中に存在する場合があります（例：コドン106-108の6塩基対の欠失）。
• 突然変異はアンチトロンビン遺伝子のmRNAプロセシングに影響を与える可能性があります。
• わずかな挿入または削除は、フレームシフト変異とアンチトロンビン遺伝子の早期終了につながる可能性があります。
• 点突然変異は、終止コドンまたは終止コドンの早期生成をもたらす場合もあります。例えば、コドン129の突然変異、CGA→TGA（転写後のUGA）は、アルギニンの通常のコドンを終止コドンに置き換えます。

タイプIIアンチトロンビン欠乏症は、正常なアンチトロンビンレベルを特徴としますが、罹患者の血液中のアンチトロンビン活性が低下します。もともと、II型欠損症は、どのアンチトロンビン機能活性が低下または保持されるかに応じて、3つのサブグループIIa、IIbおよびIIcにさらに分割されることが提案されました。

• サブグループIIa-トロンビン不活性化の減少、第Xa因子不活性化の減少、ヘパリン親和性の減少。
• サブグループIIb-トロンビンの不活性化と正常なヘパリン親和性の低下。
• サブグループIIc-正常なトロンビン不活性化、正常な第Xa因子不活性化、およびヘパリン親和性の低下。

血栓症および止血に関する国際学会の科学および標準化委員会によって再度採用された分類の改訂されたシステムでは、タイプIIアンチトロンビン欠乏症は、3つのサブグループに細分されたままです：すでに述べたタイプII PEと、タイプII RS変異がアンチトロンビンヘパリン結合部位に影響を与える反応部位およびII型HBS。血栓症および止血に関する国際学会の科学および標準化委員会の血漿凝固阻害剤小委員会のメンバーによってコンパイルされたアンチトロンビン変異データベースの目的のために、IIa型の症例はII型のPE、IIb型の症例はII型RSとして分類されるようになりましたタイプII HBSとしてのタイプIIcケース。

トポニム

現在、特定のアンチトロンビン遺伝子変異を特徴づけることは比較的簡単です。しかし、現代の特徴付け技術を使用する前に、研究者は、欠損症に苦しむ個人が居住した町または都市の突然変異、すなわちアンチトロンビン突然変異がトポニームと命名された都市の突然変異と命名しました。それ以来、現代の突然変異の特徴づけは、多くの個々のアンチトロンビントポニムが実際には同じ遺伝子突然変異の結果であることを示しています。例えば、アンチトロンビン-トヤマは、アンチトロンビン-熊本、-アミエン、-ツアー、-パリ-1、-パリ-2、 -Alger、-Padua-2、および-バルセロナ。

医療用途

アンチトロンビンは、ヒトの血漿から精製したり、組換え生産したりできるタンパク質治療薬として使用されます（たとえば、遺伝子組み換えヤギの乳汁で生産されるAtrynなど）。

アンチトロンビンは、遺伝性アンチトロンビン欠乏症患者の手術または出産前、出産中、または出産後の血餅の予防のための抗凝固剤としてFDAによって承認されています。

アンチトロンビンは、びまん性血管内凝固および他の結果を減らすために敗血症で研究されています。敗血症の重症患者に利益をもたらすことは発見されていません。

切断された潜在的なアンチトロンビン

反応部位での切断は、ループがベータシートAの中央に余分な第6鎖を形成するように、結合したプロテアーゼとともに切断された反応部位ループの動きを伴うトロンビンプロテアーゼの捕捉をもたらす。この反応部位の動きループは開裂せずに誘導することもでき、結果として生じる結晶学的構造はプラスミノーゲン活性化因子阻害剤-1（PAI-1）の生理学的に潜在的な立体構造と同一です。このため、反応部位ループがタンパク質の本体に切断されずに組み込まれているアンチトロンビンの立体構造は、潜在的アンチトロンビンと呼ばれます。 PAI-1とは対照的に、アンチトロンビンの正常または天然の立体構造から潜在的な立体構造への移行は不可逆的です。

天然アンチトロンビンは、単独で加熱するか、クエン酸塩の存在下で加熱することにより、潜在性アンチトロンビン（L-アンチトロンビン）に変換できます。ただし、極端な加熱がなく、37℃（体温）では、血液中を循環するすべてのアンチトロンビンの10％が24時間でLアンチトロンビンに変換されます。 L-アンチトロンビンの構造を図6に示します 。

天然アンチトロンビンの3次元構造は1994年に初めて決定されました。予想外に、タンパク質は天然アンチトロンビン1分子と潜在アンチトロンビン1分子で構成されるヘテロダイマーとして結晶化しました。形成中の潜在的アンチトロンビンは、天然のアンチトロンビンの分子と直ちにリンクしてヘテロダイマーを形成し、潜在的アンチトロンビンの濃度がアンチトロンビン全体の50％を超えて初めて分析的に検出できます。アンチトロンビンの潜在型は、その標的凝固プロテアーゼに対して不活性であるだけでなく、そうでなければ活性な天然のアンチトロンビン分子との二量体化により、天然の分子が不活性化されます。潜在的アンチトロンビン形成またはその後の二量体形成によるアンチトロンビン活性の損失の生理学的影響は、α-アンチトロンビンとは対照的に、ヘパリン活性化β-アンチトロンビンと潜在的アンチトロンビンとの間で二量体化が生じることにより悪化する。

アンチトロンビンのネイティブ型と潜在型の間の変換の中間体であるアンチトロンビンの型も分離されており、これは潜在的アンチトロンビンと呼ばれています。

抗血管新生アンチトロンビン

血管新生は、既存の血管か​​らの新しい血管の成長を伴う生理学的プロセスです。通常の生理学的条件下では、血管新生は厳しく規制されており、血管新生刺激剤と血管新生阻害剤のバランスによって制御されます。腫瘍の成長は血管新生に依存しており、腫瘍の発達中は、腫瘍細胞が産生する血管新生阻害因子の量の減少とともに、血管新生刺激因子の持続的な産生が必要です。アンチトロンビンの切断された潜在型は、動物モデルで血管新生と腫瘍成長を強力に阻害します。アンチトロンビンの潜在型はin vitroで血管新生を阻害することが示されていますが、今日まで実験動物モデルでテストされていません。